血小板裂解液hPL体内外扩增CAR-T细胞的抗肿瘤效应研究|血清替代物

摘要： 本文梳理hPL替代FBS或ABS用于CAR-T细胞培养的研究，重点总结其对低分化TN/TCM表型、TGFβ1相关作用、长期体外增殖、体内持久性及抗肿瘤效应的影响，并介绍Sexton相关hPL产品体系在免疫细胞培养中的应用参考。

关键词：人血小板裂解液、hPL、CAR-T细胞、CAR-T细胞扩增、FBS替代、ABS替代、T细胞低分化表型、中央记忆T细胞、TGFβ1、体内持久性、抗肿瘤效应、Sexton、nLiven PR、T-Liven PR

前言

CAR-T细胞治疗中，体内T细胞持久性和较好的治疗结果之间存在一定相关性。本文整理的研究强调，在不额外进行基因修饰的前提下，通过调整CAR-T细胞培养物补充剂，也可能改善CAR-T细胞制造结果。研究重点探索了人血衍生制品作为培养基补充剂对CAR-T细胞表型的影响，发现使用hPL作为一种GMP级培养补充剂替换传统FBS或ABS血清，可在一定程度上使T细胞在TN期和TCM期维持较低分化表型，并在体内外与靶细胞长期共培养的实验条件下展示较好的抗肿瘤效应。Sexton hPL相关资料可参考Sexton人血小板裂解液技术资料参考。

1-1 CAR-T细胞在hPL体外培养体系中获得维持低分化T细胞表型

为了评估细胞体外扩增阶段不同人血衍生物对CAR-T细胞功能的影响，研究者首先将在添加10%胎牛血清培养基中培养的OKT3/CD28刺激T细胞，使用表达第二代前列腺干细胞抗原PSCA或CD19特异性CAR的逆转录病毒载体进行转导，CAR结构包含CD28和CD3ζ内结构域，由此获得P28z和1928z两种T细胞。转导后第3天，T细胞培养被分成三组，分别在添加10%胎牛血清、10% ABS和10% hPL的培养基中继续培养扩增1周，本实验中每组均添加相同量IL-2。

图1a：实验设计时间线

扩增结果发现，三种培养补充剂中T细胞扩增总体无统计学差异。然而，当研究者检查扩增细胞的表型图谱时，hPL培养组中的细胞显示，在CD8+和CD4+ T细胞部分中，代表初始T细胞TN和中央记忆T细胞TCM的CCR7+细胞比例明显更高。

图1c和1d：P28z和1928z两种T细胞在FBS/ABS/hPL不同培养体系中扩增时TN/TCM的比例

此外，研究者还探索了与记忆CD62L、CD127、CD27和CD28，激活CD25和CD69，以及抑制PD1和TIM3相关的其他细胞表面marker表达。hPL扩增细胞中CD25、CD69、PD1和TIM3表达增加，而ABS扩增细胞中CD25、CD69、PD1和TIM3表达降低；在ABS中扩增的细胞在CD8+和CD4+ T细胞亚群中CD62L+表达较低，并且非转导T细胞、P28z和1928z中的CD4+ T细胞中CD27+CD28+群体数量减少。

图S1c：P28z和1928z两种T细胞在FBS/ABS/hPL不同培养体系中相关细胞表面marker表达01

图S1d：P28z和1928z两种T细胞在FBS/ABS/hPL不同培养体系中相关细胞表面marker表达02

此外，研究者发现较低hPL浓度，低至2.5%时，也不会破坏T细胞生长或表型；相比之下，FBS在浓度低于5%时会阻碍T细胞扩增。

图S2-01：不同浓度梯度FBS/ABS/hPL的T细胞体外培养效果

图S2-02：不同浓度梯度FBS/ABS/hPL的T细胞体外培养效果

研究者进一步通过RNA-seq分析第7天更换培养基后P28z修饰细胞的特性，发现hPL培养组细胞群中高表达TN/TCM相关基因，例如LEF1、FOXP1和KLF1，同时较少表达效应T细胞TE相关基因，包括编码转录因子的TBX21、EOMES和KLRG1，以及效应分子如颗粒酶、穿孔素和IFNγ。因此，根据以上表型和基因表达谱结果，在hPL中扩增的T细胞培养物更有利于具有TN/TCM特征的细胞亚群扩增。

1-2 TGFβ1在维持低分化CAR-T细胞表型方面的影响和作用

在以上两种不同CAR模型中，由于hPL培养组T细胞始终优于ABS或FBS对应的T细胞，研究者试图确定具体影响T细胞表型的成分。首先，实验人员对ABS和hPL进行了人类蛋白质组学分析，发现与ABS相比，hPL含有更高水平的转化生长因子β1，也就是TGFβ1。由于既往研究发现TGFβ1可以阻止T细胞分化，并促进活化和记忆T细胞存活，因此初步判断TGFβ1对维持低分化T细胞表型有一定影响。

为了探索TGFβ1对记忆T细胞表型的特异性影响，研究者继续在FBS和ABS培养物中添加重组TGFβ1，浓度为5 ng/mL，使其水平接近10% hPL培养物中的相当水平。作为额外对照，研究者使用转基因表达显性阴性TGFβ受体II的T细胞来中和hPL中的TGFβ1。通过TGFβ1补充，实验者观察到FBS和ABS培养中CCR7+细胞比例更高，而DNRII T细胞的替代消除了hPL对CCR7表达的影响。因此，借助重组TGFβ1实验可以看到，TGFβ1对T细胞具有免疫调节作用，但这种外源性补充的TGFβ1对CAR-T细胞的细胞裂解能力存在不利影响；hPL培养组CAR-T细胞的表型和功能特征可能是多种可溶性蛋白共同作用的结果，TGFβ1可能是其中之一。

2 体外长期共培养实验中，hPL培养的CAR-T细胞显示出更高增殖能力并产生更强抗肿瘤效应

上文提到，hPL培养的TN和TCM亚群在抗原刺激下比TE具有更高增殖能力。因此，实验人员使用CellTrace Violet染料标记每种实验条件下的P28z或1928z T细胞，然后分别使用Capan-1PSCA或NALM6细胞刺激。培养5天后，研究者基于CTV稀释和CAR-T细胞凋亡，也就是Annexin V和7AAD染色，评估细胞增殖。如图3a所示，hPL扩增的P28z和1928z T细胞在抗原刺激下细胞分裂数量显著增加，凋亡减少。P28z模型中Annexin V+凋亡细胞比例为FBS组52.1±7.2%、ABS组59.4±2.9%、hPL组26.7±3.4%；1928z模型中为FBS组80.0±2.4%、ABS组74.9±1.7%、hPL组41.3±2.9%。

图3a和3b：FBS/ABS/hPL组CAR-T细胞增殖和抗肿瘤反应的影响。P28z或1928z T细胞用CTV染色，分别与Capan-1PSCA或NALM6共培养5天，并使用CellTrace Violet进行细胞增殖试验和凋亡细胞检测。

由于本研究中观察到hPL扩增CAR-T细胞短期细胞毒性减弱但增殖能力增强，实验人员接下来评估了由细胞增殖及细胞毒性效应共同影响的T细胞治疗长期体外抗肿瘤效果。因此，研究继续进行了9天体外共培养实验，同时监测肿瘤细胞杀伤和T细胞扩增情况。

P28z T细胞与Capan-1PSCA共培养结束时，hPL培养的P28z T细胞具有较强抗肿瘤活性。各组详细数据为：肿瘤细胞倍增率FBS组1.4±0.5，ABS组1.9±0.8，hPL组0.4±0.2；T细胞倍增率FBS组5.6±3.2，ABS组5.7±1.7，hPL组24.7±3.7。

图3c和3d：体外长期共培养实验。P28z T细胞与Capan-1PSCA细胞共培养，或1928z T细胞与NALM6细胞共培养9天，每3天收集细胞并用流式细胞仪计数。

同样地，hPL培养的1928z T细胞比其他血清条件下的细胞增殖更快、更稳健。第3天细胞扩增数据为FBS组1.8±0.3，ABS组1.8±0.3，hPL组3.4±0.3。第9天NALM6清除相关数据中，肿瘤细胞扩增倍数为FBS组15.5±10.0，ABS组20.2±14.7，hPL组0.06±0.03。总之，在长期体外T细胞与肿瘤细胞共培养实验中，由于hPL培养CAR-T细胞具备更高增殖能力，其整体肿瘤控制效果优于在FBS或ABS中扩增的CAR-T细胞。

3-1 hPL扩增的P28z T细胞在体内抗肿瘤作用增强

为了评估不同人血衍生物作为补充剂培养条件下的CAR-T细胞在体内的抗肿瘤作用，研究者将Capan-1PSCA细胞移植到小鼠体内，并在肿瘤达到约100 mm³时静脉注射GFP/FL标记的P28z T细胞。无论培养条件如何，研究者观察到肿瘤部位P28z T细胞扩增水平相似。然而，当通过caliper测量评估每只小鼠的最大抗肿瘤反应时，即从T细胞治疗后的第10天到第35天，hPL培养组P28z T细胞治疗动物有更好结果，hPL组中9/12无肿瘤，FBS组1/12无肿瘤，ABS组2/12无肿瘤。在CAR-T细胞治疗后第112天跟踪各组肿瘤复发情况，发现仍有小鼠没有肿瘤，而复发小鼠的复发较晚，并且与抗原阴性复发相关。

图5：P28z T细胞持久性及对肿瘤再发模型的抗肿瘤作用

进一步研究体内hPL培养组细胞是否表现出更好的持久性和保护能力时，实验人员进行了肿瘤复发模型实验。该模型中，对清除原发肿瘤的小鼠在对侧腹部再次移植入相同肿瘤细胞。CAR-T细胞治疗42天后，研究者观察到大多数动物已经消除原发肿瘤。P28z hPL T细胞处理小鼠中，部分出现肿瘤生长延迟，部分完全清除肿瘤；P28z FBS T细胞处理小鼠中，仅少数小鼠出现肿瘤生长延迟；P28z ABS组小鼠则与对照区别有限。研究者还评估了T细胞在肿瘤再发模型中的持久性，发现P28z hPL T细胞生物发光显著更高，说明原发肿瘤清除后维持时间更长。这些P28z T细胞能够迁移到新肿瘤部位，扩增并产生细胞毒性，从而延缓肿瘤生长或完全清除肿瘤。

3-2 hPL扩增的1928z T细胞在体内表现出更高增殖能力和消除NALM6肿瘤能力

为了研究hPL培养CAR-T细胞的抗肿瘤效果是否超出Capan-1PSCA模型，研究者继续进行了第二个异种移植小鼠模型。实验中，通过GFP/FL+ NALM6细胞静脉移植小鼠，3天后输注1928z T细胞，剂量为5×10⁶细胞/小鼠。结果发现，使用FBS或ABS培养细胞治疗的小鼠随后不久复发，而使用hPL培养CAR-T细胞治疗的小鼠产生了较长无瘤生存期，这与T细胞治疗后第8天和第13天的优势T细胞数量有关。

图6：1928z T细胞在FBS/ABS/hPL中扩增后的体内表现

由于NALM6肿瘤细胞优先定位于骨髓和次生淋巴样器官，实验者也通过将GFP/FL转导的1928z T细胞输注到NALM6小鼠中追踪T细胞迁移和扩增情况。结果显示，1928z hPL T细胞在疾病部位快速而稳健地扩增，并且比FBS或ABS中的1928z T细胞扩增持续时间更长。这些发现在高T细胞剂量下也得到了重现。总体来看，这些数据表明，CAR-T细胞在hPL中的体外扩增增强了CAR-T细胞功能。

结论

与FBS或ABS相比，hPL培养体系中的CAR-T细胞表现出更高增殖能力和增强的长期体内持久性，从而产生更优的抗肿瘤效果。这些数据提示，hPL可作为CAR-T细胞产品体外制备中的培养补充剂候选方向。值得注意的是，hPL来自多个可输血供者的血小板，最初开发目的之一是支持MSC体外扩增，用于临床相关细胞制备研究。这项研究属于较早系统评估hPL作为培养基补充剂对CAR-T细胞表型和功能影响的研究之一。

Sexton相关人血小板裂解液产品包括经典Stemulate血清替代产品，以及面向免疫细胞治疗方向的nLiven PR和T-Liven PR。nLiven PR和T-Liven PR涉及病原体去除工艺，其中T-Liven PR为封闭袋装系统形式，适合关注封闭化和临床级工艺开发的细胞治疗培养体系。具体应用仍需根据目标细胞类型、CAR结构、培养基体系、细胞因子组合、扩增周期和质量控制要求进行验证。

nLiven PR：涉及PR病原体去除工艺的hPL，免疫细胞治疗用

T-Liven PR：涉及PR病原体去除工艺的封闭袋装系统hPL

参考文献

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4. Torres Chavez et al. Expanding CAR T cells in human platelet lysate renders T cells with in vivo longevity. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 2019;7:330.

关于技术来源

本文基于Sexton Biotechnologies公开资料及相关研究文献信息曼博生物整理，用于科研信息分享、实验参考和hPL在CAR-T细胞扩增中的应用理解。hPL用于CAR-T培养涉及FBS/ABS替代、OKT3/CD28刺激、逆转录病毒转导、P28z和1928z CAR-T模型、TN/TCM表型、CCR7表达、TGFβ1、长期体外共培养、体内持久性和抗肿瘤功能评价等多项变量，实际应用前仍需结合具体实验条件进行验证。
本文围绕Sexton Stemulate、nLiven PR、T-Liven PR、人血小板裂解液hPL、CAR-T细胞扩增、FBS替代、ABS替代和免疫细胞培养体系开发等方向提供产品信息与技术资料支持。本文不作为临床应用建议，仅供科研与工艺开发参考。