血清替代物hPL替代FBS/ABS用于CAR-T扩增：低分化T细胞表型、体内持久性与抗肿瘤效应解析

摘要： CAR-T细胞治疗的体内持久性与治疗效果之间存在重要关联，而体外扩增阶段的培养体系会直接影响终产品细胞的表型、增殖能力和抗原再刺激后的功能表现。传统CAR-T扩增中常使用FBS或人AB血清（ABS）作为培养补充剂，但其异种来源、批次差异和临床级生产适配性等问题，使无动物源且更适合GMP流程的替代体系持续受到关注。本文围绕一项关于人血小板裂解液hPL替代FBS/ABS用于CAR-T细胞扩增的研究，系统梳理hPL对TN/TCM低分化表型、TGFβ1相关作用、长期体外增殖、体内持久性及抗肿瘤效应的影响，并结合Sexton相关hPL产品体系，讨论其在免疫细胞治疗工艺开发中的参考价值。

关键词：人血小板裂解液、hPL、CAR-T细胞、CAR-T细胞扩增、FBS替代、ABS替代、T细胞低分化表型、中央记忆T细胞、TGFβ1、体内持久性、抗肿瘤效应、Sexton、nLiven PR、T-Liven PR

CAR-T扩增阶段为什么要关注培养补充剂

CAR-T细胞疗法的核心并不只是把T细胞成功转导CAR结构，而是要在体外制造阶段获得数量足够、表型合适、功能稳定且能够在体内持续发挥作用的CAR-T细胞产品。越来越多研究提示，CAR-T细胞的体内持久性与较好的治疗结果之间存在一定相关性，而体外扩增阶段的培养条件会直接影响T细胞分化程度、记忆表型、抗原再刺激后的增殖能力以及长期抗肿瘤效应。因此，培养基补充剂并不是简单的“营养成分”，而是CAR-T制造工艺中的关键变量之一。

传统T细胞体外培养中，胎牛血清FBS和人AB血清ABS都曾被广泛使用。FBS能够支持细胞生长，但存在动物源背景和临床级制备适配性问题；ABS来源于人血清，相比FBS减少异种来源风险，但批次差异、供应稳定性和功能一致性仍需要关注。人血小板裂解液hPL来源于人血小板，富含多种血小板来源生长因子和可溶性因子，最初在MSC扩增中应用较多，后来逐渐被用于免疫细胞培养体系探索。相关Sexton hPL与细胞治疗培养补充剂资料，可参考Sexton人血小板裂解液技术资料页面。

本篇整理的研究围绕hPL作为培养补充剂对CAR-T细胞表型和功能的影响展开。研究者比较了10% FBS、10% ABS和10% hPL三种培养体系对CAR-T细胞扩增、TN/TCM低分化表型维持、TGFβ1相关信号、长期共培养抗肿瘤效应以及体内模型中细胞持久性和抗肿瘤表现的影响。整体结果显示，hPL培养体系并未显著改变总体扩增量，但更有利于获得具有TN/TCM特征的低分化T细胞亚群，并在长期抗原刺激环境中展现出更强增殖能力和更持续的抗肿瘤效应。

hPL培养体系对CAR-T细胞低分化表型的影响

研究者首先将OKT3/CD28刺激的T细胞在10% FBS培养基中培养，并使用表达第二代CAR结构的逆转录病毒载体进行转导。实验中构建了两类CAR-T细胞模型：一类为针对前列腺干细胞抗原PSCA的P28z T细胞，另一类为针对CD19的1928z T细胞，两者均包含CD28和CD3ζ内结构域。转导后第3天，T细胞被分为三组，分别转入含10% FBS、10% ABS或10% hPL的培养基中扩增1周，且各组均添加相同量IL-2，以便比较培养补充剂本身对T细胞状态的影响。

图1a：实验设计时间线

扩增结果显示，三种培养补充剂条件下T细胞总体扩增量没有显著统计学差异。这一点很关键，因为它说明hPL并不是单纯通过提高短期细胞增殖数量来体现优势。真正的差异出现在细胞表型层面。研究者检查扩增后细胞的表型图谱发现，在hPL培养组中，CD8+和CD4+ T细胞亚群里代表初始T细胞TN和中央记忆T细胞TCM的CCR7+细胞比例更高。TN/TCM表型通常被认为与较低分化程度、较强增殖潜力和更好的体内持久性相关，因此这一结果提示hPL可能帮助CAR-T细胞在体外扩增过程中保留更有利的低分化特征。

图1c和1d：P28z和1928z两种T细胞在FBS/ABS/hPL不同培养体系中扩增时TN/TCM的比例

研究还进一步检测了与记忆、激活和抑制相关的多个细胞表面标志物。结果显示，hPL扩增的细胞中CD25、CD69、PD1和TIM3表达增加，而ABS扩增的细胞中这些标志物表达降低；与此同时，ABS扩增细胞在CD8+和CD4+ T细胞亚群中CD62L+表达较低，并且非转导T细胞、P28z和1928z中的CD4+ T细胞里CD27+CD28+群体数量减少。这说明不同培养补充剂并不只是影响“细胞长不长”，还会改变T细胞激活、记忆和分化相关表型的平衡。

图S1c：P28z和1928z两种T细胞在FBS/ABS/hPL不同培养体系中相关细胞表面marker表达01

图S1d：P28z和1928z两种T细胞在FBS/ABS/hPL不同培养体系中相关细胞表面marker表达02

较低浓度hPL仍能支持T细胞生长和表型维持

培养补充剂用于CAR-T制造时，除了功能表现，还需要考虑成本、批次稳定性和工艺可放大性。研究者进一步测试了不同浓度梯度的FBS、ABS和hPL对T细胞体外培养的影响。结果显示，较低浓度hPL，甚至低至2.5%，也不会破坏T细胞生长或表型；相比之下，FBS在浓度低于5%时会阻碍T细胞扩增。这一结果提示，hPL在较低添加比例下仍可维持T细胞扩增和表型状态，对后续培养体系优化具有参考意义。

图S2-01：不同浓度梯度FBS/ABS/hPL的T细胞体外培养效果

图S2-02：不同浓度梯度FBS/ABS/hPL的T细胞体外培养效果

为了进一步从分子层面解释hPL培养组的表型变化，研究者对第7天更换培养基后的P28z修饰细胞进行了RNA-seq分析。结果发现，hPL培养组细胞高表达TN/TCM相关基因，例如LEF1、FOXP1和KLF1，同时较少表达效应T细胞相关转录因子和效应分子，例如TBX21、EOMES、KLRG1、颗粒酶、穿孔素和IFNγ。结合表型和基因表达谱结果，可以认为hPL培养环境更有利于具有TN/TCM特征的细胞亚群扩增，而不是快速推向终末效应化状态。

TGFβ1可能参与hPL维持低分化表型的作用

在P28z和1928z两种CAR模型中，hPL培养组T细胞表型均优于FBS或ABS对应组。为了进一步寻找可能影响T细胞表型的成分，研究者对ABS和hPL进行了人类蛋白质组学分析，发现与ABS相比，hPL含有更高水平的转化生长因子β1（TGFβ1）。既往研究曾提示，TGFβ1可以阻止T细胞分化，并促进活化和记忆T细胞存活，因此研究者初步判断TGFβ1可能是hPL维持低分化T细胞表型的重要因素之一。

为了验证TGFβ1对记忆T细胞表型的特异性影响，研究者在FBS和ABS培养体系中补充重组TGFβ1，使其达到与10% hPL培养物相当的水平。作为额外对照，研究者还使用转基因表达显性阴性TGFβ受体II的T细胞，以中和hPL中的TGFβ1作用。结果显示，补充TGFβ1后，FBS和ABS培养体系中CCR7+细胞比例升高；而使用DNRII T细胞后，hPL对CCR7表达的影响被消除。这说明TGFβ1确实参与了hPL维持低分化表型的机制。

不过，研究也提示，外源性补充TGFβ1虽然可影响T细胞表型，但对CAR-T细胞的细胞裂解能力存在不利影响。也就是说，hPL培养组CAR-T细胞的表型和功能特征并不能简单归因于单一TGFβ1成分，而更可能是多种可溶性蛋白共同作用的结果。TGFβ1可能是其中一个重要因素，但hPL的整体效应需要放在复杂人源血小板裂解液微环境中理解。

长期体外共培养：hPL培养CAR-T细胞表现出更强增殖和持续抗肿瘤效应

由于hPL培养的TN和TCM亚群在抗原刺激下可能具有更高增殖能力，研究者进一步使用CellTrace Violet染料标记不同培养条件下的P28z或1928z T细胞，并分别用Capan-1PSCA或NALM6细胞刺激。培养5天后，研究者基于CTV稀释和Annexin V/7AAD染色评估细胞增殖与凋亡。结果显示，hPL扩增的P28z和1928z T细胞在抗原刺激下细胞分裂数量明显增加，同时凋亡减少。P28z模型中，Annexin V+凋亡细胞比例在FBS组为52.1±7.2%，ABS组为59.4±2.9%，hPL组为26.7±3.4%；1928z模型中，FBS组为80.0±2.4%，ABS组为74.9±1.7%，hPL组为41.3±2.9%。

图3a和3b：FBS/ABS/hPL组CAR-T细胞增殖和抗肿瘤反应的影响。P28z或1928z T细胞用CTV染色，分别与Capan-1PSCA或NALM6共培养5天，并使用CellTrace Violet进行细胞增殖试验和凋亡细胞检测。

在短期实验中，hPL扩增的CAR-T细胞虽然表现出短期细胞毒性减弱，但增殖能力增强。因此，研究者继续设计了9天体外长期共培养实验，同时监测肿瘤细胞杀伤和T细胞扩增。P28z T细胞与Capan-1PSCA共培养结束时，hPL培养的P28z T细胞表现出更强的整体抗肿瘤活性。肿瘤细胞倍增率分别为FBS组1.4±0.5、ABS组1.9±0.8、hPL组0.4±0.2；T细胞倍增率分别为FBS组5.6±3.2、ABS组5.7±1.7、hPL组24.7±3.7。这说明hPL组CAR-T细胞在长期共培养中依靠更强增殖能力实现了更好的肿瘤控制。

图3c和3d：体外长期共培养实验。P28z T细胞与Capan-1PSCA细胞共培养，或1928z T细胞与NALM6细胞共培养9天，每3天收集细胞并用流式细胞仪计数。

在1928z T细胞与NALM6细胞共培养模型中，hPL培养的1928z T细胞同样比FBS或ABS培养组增殖更快、更稳健。第3天细胞扩增数据为FBS组1.8±0.3、ABS组1.8±0.3、hPL组3.4±0.3；第9天NALM6肿瘤细胞扩增倍数为FBS组15.5±10.0、ABS组20.2±14.7、hPL组0.06±0.03。综合来看，在长期抗原刺激环境中，hPL培养的CAR-T细胞由于具备更高增殖能力，整体抗肿瘤效果优于FBS或ABS培养的CAR-T细胞。

体内模型：hPL扩增CAR-T细胞表现出更好的持久性和抗肿瘤效果

为了评估不同培养补充剂条件下CAR-T细胞的体内抗肿瘤作用，研究者将Capan-1PSCA细胞移植至小鼠体内，并在肿瘤达到约100 mm³时静脉注射GFP/FL标记的P28z T细胞。实验观察到，不同培养条件下肿瘤部位P28z T细胞扩增水平相似，但通过测量治疗后第10天至第35天最大抗肿瘤反应发现，hPL培养组P28z T细胞治疗动物具有更好的结果。hPL组中9/12动物无肿瘤，FBS组为1/12，ABS组为2/12。随访至CAR-T细胞治疗后第112天，hPL组中仍有小鼠保持无肿瘤状态，复发个体则表现为抗原阴性复发。

图5：P28z T细胞持久性及对肿瘤再发模型的抗肿瘤作用

为了进一步验证hPL培养组细胞是否具备更好的持久性和保护能力，研究者建立了肿瘤复发模型。在该模型中，对已清除原发肿瘤的小鼠于对侧腹部再次移植相同肿瘤细胞。CAR-T细胞治疗42天后，大多数动物已清除原发肿瘤。重新挑战后，P28z hPL组小鼠中部分出现肿瘤生长延迟，部分完全清除肿瘤；而FBS组仅有少数小鼠表现为肿瘤生长延迟，ABS组则接近对照。进一步追踪T细胞持久性发现，P28z hPL组T细胞生物发光信号更高，提示原发肿瘤清除后细胞维持时间更长，并能迁移至新肿瘤部位扩增、发挥细胞毒性，从而延缓或清除再次出现的肿瘤。

研究者还在第二个异种移植小鼠模型中验证hPL培养CAR-T细胞的体内表现。该模型使用GFP/FL+ NALM6细胞静脉移植小鼠，3天后输注1928z T细胞。结果显示，使用FBS或ABS培养细胞治疗的小鼠较快复发，而使用hPL培养CAR-T细胞治疗的小鼠出现更长无瘤生存期，这与T细胞治疗后第8天和第13天更高T细胞数量相关。由于NALM6肿瘤细胞优先定位于骨髓和次生淋巴样器官，研究者进一步追踪了1928z T细胞迁移和扩增情况，发现1928z hPL T细胞在疾病部位快速且稳健扩增，并且持续时间长于FBS或ABS培养组。

图6：1928z T细胞在FBS/ABS/hPL中扩增后的体内表现

Sexton hPL产品体系与CAR-T制造工艺开发的关系

从工艺角度看，hPL用于CAR-T扩增的意义并不只是替代FBS或ABS，而是为免疫细胞治疗制造提供一种更适合临床级生产逻辑的人源培养补充剂选择。美国Sexton公司的人血小板裂解液体系包含经典Stemulate血清替代产品，也包括面向免疫细胞治疗方向的nLiven PR和T-Liven PR。原文提到，nLiven PR和T-Liven PR涉及病原体去除工艺，其中T-Liven PR为袋装封闭系统产品形式，可适配更封闭化的细胞治疗工艺开发需求。

nLiven PR：涉及PR病原体去除工艺的hPL，免疫细胞治疗用

T-Liven PR：涉及PR病原体去除工艺的封闭袋装系统hPL

在CAR-T和其他免疫细胞制造中，培养补充剂需要同时满足细胞性能、质量体系和工艺适配性要求。hPL如果能够在维持T细胞低分化表型、增强抗原再刺激后的增殖能力和提高体内持久性方面提供支持，就有助于为CAR-T制造工艺优化提供新的变量。不过，具体应用仍需根据CAR结构、T细胞来源、激活方式、培养基体系、细胞因子组合、扩增周期和终产品放行标准进行验证。

小结

这项研究提示，相比FBS或ABS，hPL培养体系能够让CAR-T细胞在体外扩增过程中更倾向于维持TN/TCM低分化表型，并在长期抗原刺激中表现出更强增殖能力和更低凋亡水平。在P28z和1928z两个CAR-T模型中，hPL培养细胞均在长期体外共培养和体内模型中展现出更好的持续抗肿瘤表现。机制层面，hPL中较高水平的TGFβ1可能参与CCR7+低分化表型维持，但hPL的整体效应更可能来自多种可溶性因子共同作用，而不是单一组分决定。

对于CAR-T制造工艺开发而言，培养补充剂的选择会影响细胞扩增数量、分化状态、抗原再刺激能力、体内持久性和长期功能。hPL作为FBS/ABS替代方向之一，值得在免疫细胞治疗培养体系中进行更系统的工艺验证。实际应用时，应结合具体CAR靶点、CAR结构、T细胞亚群、培养周期、细胞因子组合和GMP质量体系进行综合评估。

FAQ常见问题解答

1. hPL替代FBS或ABS用于CAR-T扩增的核心价值是什么？

hPL的核心价值不只是支持CAR-T细胞数量扩增，而是可能帮助T细胞在体外制造阶段保留更多TN/TCM低分化表型。低分化T细胞通常具有更好的抗原再刺激增殖能力和体内持久性，这对CAR-T长期抗肿瘤效应具有重要意义。

2. hPL培养组为什么短期细胞毒性可能较弱，但长期抗肿瘤效果更好？

研究中hPL培养CAR-T细胞在短期细胞毒性方面并不一定更强，但其在抗原刺激后增殖能力更高、凋亡更少，因此在长期共培养和体内模型中能够维持更持续的T细胞数量和抗肿瘤效应。对于CAR-T产品来说，长期扩增和持久性往往比单次短期杀伤更能影响整体疗效。

3. TGFβ1在hPL维持低分化表型中起什么作用？

研究发现hPL中TGFβ1水平高于ABS，并且补充TGFβ1可提高FBS/ABS培养体系中CCR7+细胞比例，使用显性阴性TGFβ受体II则可削弱hPL对CCR7表达的影响。这说明TGFβ1参与低分化表型维持，但hPL的整体功能很可能由多种可溶性蛋白共同决定。

4. Sexton nLiven PR和T-Liven PR适合哪些方向关注？

nLiven PR和T-Liven PR更偏向免疫细胞治疗和临床级工艺开发场景，特点包括人源hPL补充剂、病原体去除工艺和封闭化工艺适配等方向。具体使用前仍需结合CAR-T、TCR-T、TIL或NK等不同免疫细胞体系进行验证。

参考文献

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关于技术来源

本文基于Sexton Biotechnologies公开资料及相关研究文献信息曼博生物整理，用于科研信息分享、实验参考和CAR-T细胞扩增培养体系优化思路参考。hPL用于CAR-T培养涉及T细胞来源、CAR结构、激活方式、转导体系、FBS/ABS对照、hPL浓度、IL-2添加、TN/TCM表型、TGFβ1相关信号、体外长期共培养、体内持久性和抗肿瘤功能等多项变量，实际应用前仍需结合具体实验条件进行验证。
本文围绕Sexton Stemulate人血小板裂解液、nLiven PR、T-Liven PR、CAR-T细胞扩增、FBS替代、ABS替代、免疫细胞治疗培养体系和低分化T细胞表型维持等方向提供产品信息与技术资料支持。本文不作为临床应用建议，仅供科研与工艺开发参考。