慢性腎臓病におけるルビプロストン：無作為化第2相臨床試験から得られたミトコンドリア機能とポリアミンに関する知見
慢性腎臓病におけるルビプロストン：無作為化第2相臨床試験から得られたミトコンドリア機能とポリアミンに関する知見
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adw3934
慢性便秘治療薬ルビプロストンの腎保護作用を世界で初めて臨床試験で確認-腸内細菌叢の改善でミトコンドリア機能が向上-
渡辺 俊 https://orcid.org/0000-0001-6506-2606, 中山 正明, [...] , and LUBI-CKD TRIAL Investigators+36 authors Authors Info & Affiliations
Science Advances
2025年8月29日
第11巻 第35号
メトリクス
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要旨
慢性腎臓病（CKD）は生命を脅かす疾患であり、便秘はその進行性リスク因子である。我々は、CKD患者における尿毒症性毒素、腎機能、および選択的塩化物チャネル活性化剤であるルビプロストンの安全性の変化を評価した。日本国内9施設で実施されたこの第2相、無作為化、二重盲検、プラセボ対照試験では、ステージIIIb～IVのCKD患者150名が、24週間にわたりルビプロストン（8マイクログラムまたは16マイクログラム）またはプラセボを投与された。主要評価項目はインドキシル硫酸塩レベルの変化とした。副次評価項目には他の尿毒症性毒素および腎機能マーカーを含めた。ルビプロストンは尿毒症性毒素レベルを変化させなかったが、推定糸球体濾過量（eGFR）とそのスロープを16マイクログラム群で改善または維持した。軽度から中等度の消化器系有害事象はプラセボ群と16マイクログラム群で発生した。マルチオミクス解析により、ルビプロストンが腸内微生物のアグマチン経路を調節し、スペルミジンレベルを増加させ、 それにより腎ミトコンドリア機能が改善された。ルビプロストンは、CKDにおける腎機能低下を緩和する、これまで知られていなかった安全な治療選択肢である。
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はじめに
慢性腎臓病（CKD）は世界人口の多くに影響を与える一般的な健康問題であり、末期腎疾患の主要な危険因子である (1, 2)。アンジオテンシン変換酵素（ACE）阻害薬（3, 4）、アンジオテンシンII受容体拮抗薬（ARB）（5）、ナトリウム-グルコース共輸送体2（SGLT2）阻害薬（6）、ミネラルコルチコイド受容体（MR）拮抗薬 (7)、グルカゴン様ペプチド-1（GLP1）アゴニスト（8）は腎機能低下の緩和に広く用いられてきたが、透析を必要とする患者数は大幅に減少していない。便秘はCKD患者に高頻度で認められ、その重症度は推定糸球体濾過量（eGFR）の進行性低下および末期腎疾患の高リスクと関連している（9–11）。さらに、CKD患者は腸内細菌叢の異常（ディスバイオシス）を頻繁に呈し、これが「リーキーガット」として知られるバリア機能障害を引き起こす。この状態は、腸管バリアの破壊を含む生菌および細菌成分の移行増加と関連し、最終的に宿主の恒常性（ホメオスタシス）に影響を及ぼす（10）。この過程はまた、尿毒症性毒素の蓄積に寄与し、CKD患者における全身性炎症を誘発する（12）。結腸通過時間は、腸内細菌叢由来の代謝産物と粘膜のターンオーバーに関連しており（13）、CKD発症の素因となる（9）。近年、慢性便秘症に対して、ルビプロストン（塩化物チャネル活性化薬）（14）、リナクロチド（グアニル酸シクラーゼC作動薬）（15）、エロビキシバト（胆汁酸輸送体阻害薬）（16）といった新たなカテゴリーの緩下剤が導入されている（17）。我々は、便秘の改善が尿毒症性毒素レベルと腎機能を改善する可能性を検証するため、動物実験を実施した。以前、ルビプロストン（18）とリナクロチド（19）が、インドキシル硫酸（IS）、 p-クレシル硫酸（PCS）、トリメチルアミンN-オキシド（TMAO）、フェニル硫酸（20, 21）などの腸管由来尿毒症毒素を減少させることを報告している。これらの薬剤は腎不全（RF）動物モデルにおいても腎機能を改善する。最近、Sumida et al. (22)は、米国退役軍人を対象とした観察研究において、慢性腎臓病（CKD）と便秘を有する患者において、ルビプロストン使用が腎有害事象リスクの低下と独立して関連していることを報告した。これは、ルビプロストンに関する我々の基礎研究とその臨床応用を結びつける重要な観察研究である。しかし、無作為化研究が不足しているため、CKD患者における便秘治療の効果は依然として不明である。さらに、薬剤誘発性下痢による脱水リスクの可能性は、CKD患者における重大な懸念事項である。これらの課題を解決するため、我々はルビプロストンの腎保護効果を検証する無作為化二重盲検探索的第2相臨床試験を実施した。による下痢の潜在的な脱水リスクは、CKD患者における重大な懸念事項である。これらの課題を解決するため、我々はCKD患者におけるルビプロストンの腎保護効果を検証する無作為化二重盲検探索的第2相臨床試験を実施した。また、有効な治療群の探索と有害事象を引き起こさない安全な用量の決定を行った。
結果
尿毒症性毒素および腎機能に対するルビプロストンの効果
LUBI-CKD試験は、多施設共同 無作為化二重盲検プラセボ対照第2相探索的試験であり、CKD患者におけるルビプロストンの有効性と安全性を評価することを目的とした。参加者は2016年7月から2019年12月にかけて日本の9施設から募集された。主要評価項目は、各治療群（8または16μg/日）における投薬後24週時点のIS値の変化をプラセボ群と比較したものである。コホート無作為化の詳細と逸脱はCONSORT図（図1）に示す。
図1. 臨床試験フロー図
118名の参加者中、6名（ルビプロストン16μg/日群4名、プラセボ群2名）が試験を脱落した。ルビプロストン16μg/日群とプラセボ群から各1名が、試験薬投与後の初回インドキシル硫酸塩測定前に脱落したため、主要評価項目の解析対象から除外された。臨床試験登録番号：UMIN000023850.
スクリーニング対象患者150名中、適格患者118名がプラセボ群（n = 35）、ルビプロストン8μg/日群（n = 33）、 またはルビプロストン16μg/日群（n=50）に無作為に割り付けられた。このうち116例が有効性解析 （全解析対象集団、FAS）に含まれ、主要有効性評価項目が欠落した患者は除外された。治療を受けた全118例が安全性解析対象となった。プラセボ群2例（5.7%）、ルビプロストン16μg群4例（8%）が試験を中止した。中止理由は図1および表S1に示す。
ベースライン特性は3群間で概ね均衡していた（表1）。患者の平均年齢は63歳、女性の割合は34.5%であった。全参加者はアジア系民族であった。中等度腎機能障害（eGFR 36～45 ml/min/1.73 m2、n = 55）および重度腎機能障害 （eGFR 25～35 mL/min/1.73 m2、n = 61）の患者数はほぼ同数であった。さらに、患者の7.8%が糖尿病性腎症を有していた。また、レニン・アンジオテンシン系阻害薬（ARBおよびACE阻害薬）、SGLT2阻害薬、MR拮抗薬、GLP1アゴニストの使用状況も検討した。プラセボ群とルビプロストン群の間で、臨床的特徴に顕著な差異は認められなかった。
特性 平均値 (標準偏差)
プラセボ (n = 34) ルビプロストン
8 μg/日 (n = 33) 16 μg/日 (n = 49)
年齢、歳66.1 (12.1) 62.3 (13.8) 61.3 (13.0)
女性、人数（％）12 (35.3) 12 (36.4) 16 (32.7)
人種または民族グループ、人数（％）
アジア系34（100） 33（100） 49（100）
身長、cm161.4（8.4） 162.0（9.9） 164.3（10.4）
体重、kg66.0 (14.7) 66.8 (14.5) 71.5 (16.0)
eGFR、 ml/min per 1.73 m234.3 (5.1) 35.0 (6.4) 35.4 (5.0)
proteinuria, g/gCr0.7 (0.7) 0.6 (0.9) 0.7 (0.9)
併存疾患、数（％）
高血圧29 (85.3) 27 (81.8) 43 (87.8)
脂質異常症19 (55.9) 21 (63.6) 27 (55.1)
糖尿病3 (8.8) 5 (15.2) 8 (16.3)
高尿酸血症1 (2.9) 1 (3.0) 2 (4.1)
血圧, mmHg
収縮期126.7 (18.5) 126 (15.7) 127.6 (13.1)
拡張期74.0 (11.9) 70.5 (11.4) 76.8 (11.2)
飲酒歴、人数（％）
過去3 (8.8) 2 (6.1) 7 (14.3)
現在18 (52.9) 19 (57.6) 31 (63.3)
なし13 (38.2) 12 (36.4) 11(22.4)
喫煙歴、人数（％）
過去14 (41.2) 11 (33.3) 20 (40.8)
現在2 (5.9) 4 (12.1) 5 (10.2)
なし18 (52.9) 18 (54.5) 24 (49.0)
CKDの原因、件数 (%)
糖尿病性腎症2 (5.9) 2 (6.1) 5 (10.2)
慢性糸球体腎炎11 (32.4) 10 (30.3) 12 (24.5)
腎硬化症10 (29.4) 10 (30.3) 16 (32.7)
その他12 (35.3) 13 (39.4) 19 (38.8)
既往薬物療法、例数 (%)
ACE阻害薬/ARB25 (73.5) 26 (78.8) 40 (81.6)
SGLT2阻害薬1 (2.9) 2 (6.1) 1 (2.0)
GLP1アゴニスト0 0 1 (2.0)
MR拮抗薬2 (5.9) 3 (9.1) 0
eGFRカテゴリー、人数（％）
36～45 ml/min/1.73 m2（中等度）17 (50.0) 16 (48.5) 22 (44.9)
25～35 ml/min/1.73 m2（重度）17 (50.0) 17 (51.5) 27 (55.1)
表1. ベースライン時の患者特性。
連続変数は平均値±標準偏差（SD）で、分類変数は割合（％）で示す。CKD：慢性腎臓病；DKD：糖尿病性腎症；eGFR：推算糸球体濾過量；ACE：アンジオテンシン変換酵素；ARB：アンジオテンシンII受容体拮抗薬；SGLT2： ナトリウム・グルコース共輸送体2；GLP1、グルカゴン様ペプチド1；MR、ミネラルコルチコイド受容体。
主要評価項目としてIS減少を設定し、eGFR低下抑制、血中尿素窒素（BUN）値抑制、尿中タンパク質レベル抑制を副次的評価項目とした（図2、図3、表2）。ベースラインから24週時点までのISレベル変化は3群間で差が認められなかった（図2A左、表2）。プラセボ群の最小二乗平均（LSM）は0.130μg/ml［95%信頼区間（CI）：−0.168～0.429］、ルビプロストン8μg群のLSMは0.091μg/ml（95% CI：−0.211～ 0.394）、ルビプロストン16μg群では0.126μg/ml（95% CI：−0.123, 0.375）であった。中等度腎機能障害患者（eGFR：36～45 ml/min/1.73 m2；図2A中央および表S2）および重度腎機能障害患者（eGFR：25～35 ml/min/1.73 m2； 図2A右、表S3）では、いずれの群でもISレベルに変化は認められなかった。他の3つの毒素（フェニル硫酸塩、PCS、TMAO）のレベル変化も、エンドポイントでは差異がなかった（図2B～D、表2）。ただし、ルビプロストン16μg群では4週目にPCSレベルの減少が認められた （図2C）で認められた。いずれのサブグループでも変化は観察されなかった（表S2およびS3）。これらのデータは、本臨床試験においてルビプロストンが尿毒症性毒素レベルを変化させないことを示唆している。
図2. 尿毒症性毒素の変化の時間経過。
(A～D) ベースラインからのIS (A)、PS (B)、PCS (C)、TMAO (D) 濃度変化の時間経過。左：主要解析（全患者）。中央・右：サブグループ解析（CKD中等度群：eGFR 36～45 ml/min/1.73m2； CKD重度群：eGFR 25～35 ml/min/1.73m2）群。各群のLSM±95%信頼区間（CI）で示した。群間比較のP値は、各測定時点において共分散分析（ANCOVA）モデルを適用後、Dunnettの事後検定により算出。測定時点間の多重比較に対する調整は行わなかった。*P < 0.05、ルビプロストン16μg/日群対プラセボ群および†P < 0.05、ルビプロストン8μg/日群対プラセボ群。IS、 インドキシル硫酸塩；PS、フェニル硫酸塩；PCS、p-クレシル硫酸塩；TMAO、トリメチルアミンN-オキシド；LOCF、最終観察値を転記。
図3. 腎機能変化の時間経過。
(A, B, D, F) ベースラインからのBUN（A）、Cr（B）、eGFRCr（D）、eGFRCys（F）値の変化の時間経過。(C, E, G) 1/Cr（C）、eGFRCr（E）、eGFRCys （G）の傾き。［（A）から（G）］左：主要解析（全患者）。中央および右：サブグループ解析（CKD中等度群：eGFR 36～45 ml/min/1.73 m2；CKD重度群：eGFR 25～35 ml/min/1.73 m2）。1/Cr、eGFRCr、eGFRCys の傾きは、線形回帰線とともに平均値±95% CI で表され、その他は LSM ± 95% CI で表された。P値は群間比較のために以下のように算出された：1/Cr、eGFRCr、eGFRCysの傾きについては混合効果モデルが用いられ、その他のエンドポイントについては各測定時点においてANCOVAモデルが適用され、その後Dunnettの事後検定が行われた。測定時点間の多重比較に対する調整は行わなかった。*P < 0.05、**P < 0.01：ルビプロストン16μg/日群 vs プラセボ群、†P < 0.05、††P < 0.01：ルビプロストン8μg/日群 vs プラセボ群。BUN：血中尿素窒素。
LSM（95% CI）
評価項目 プラセボ（n = 34） ルビプロストン
8 μg/日（n = 33） 16 μg/日（n = 49）
主要評価項目
ISの変化
0週から24週までの変化 μg/ml0.130 (−0.168 to 0.429) 0.091 (−0.211 to 0.394) 0.126 (−0.123 to 0.375)
プラセボとのLSM差、μg/ml −0.039 (−0.519～0.440) −0.005 (−0.443～0.434)
P値 0.98 >0.99
主要副次的評価項目
PSの変化
週0から24週までの変化量、μg/ml0.187（−0.397～0.771） 0.202（−0.383～0.788） 0.460 （−0.022～0.942）
プラセボとのLSM差、μg/ml 0.015（−0.923～0.953） 0.273（−0.586～1.133）
P値 >0.99 0.69
PCSの変化
0週から24週までの変化、μg/ml0.222（−1.222～1.666） −0.280（−1.743～1.182） 0.127（−1.081～1.315）
プラセボとのLSM差、μg/ml −0.502（−2.833～1.829） −0.105（−2.223～2.012）
P値 0.84 0.99
TMAOの変化
0週から24週までの変化、μg/ml0.119 (−0.428 to 0.650) −0.407 (−0.954 to 0.141) −0.450 (−0.901 to 0.000)
プラセボとのLSM差、μg/ml −0.518（−1.384～0.349） −0.561（−1.355～0.233）
P値 0.31 0.20
eGFRcrの変化
週0から24週までの変化量、ml/分/1.73m2−1.55（−2.83から−0.27） −0.34（−1.64から0.96） 0.37 （−0.70～1.44）
プラセボとのLSM差、1.73m2あたりml/分 1.21（−0.85～3.27） 1.92（0.03～3.80）
P値 0.32 0.046
eGFRcysの変化
週0から24週までの変化、ml/分/1.73m2−1.37（−2.98～0.24） −0.87（−2.49～0.74） 0.33 (−1.01 to 1.68)
プラセボとのLSM差、1.73 m2あたりml/min 0.50 (−2.08 to 3.07) 1.70 (−0.69 to 4.10)
P値 0.87 0.19
クレアチニン値の変化
週0から24週までの変化量、mg/dl0.050（−0.008～0.107） 0.027（−0.031～0.086） −0.007（−0.055～0.041）
プラセボとのLSM差、mg/dl −0.022 (−0.115～0.070) −0.056 (−0.141～0.028)
P値 0.81 0.23
Cysの変化
0週から24週までの変化、mg/リットル0.056（−0.002～0.114） 0.013（−0.046～0.071） −0.008（−0.057～0.041）
プラセボとのLSM差、mg/リットル −0.044 (−0.136～0.049) −0.064 (−0.150～0.022)
P値 0.47 0.17
BUNの変化
0～24週からの変化、mg/dl1.71 (0.07～3.36) 0.05 (−1.63～1.72) −1.19 (−2.56～0.18)
プラセボとのLSM差、mg/dl −1.67 (−4.31～0.98) −2.90 (−5.32～−0.49)
P値 0.27 0.02
UPCRの変化
週0から24週までの変化、g/gCr0.006（−0.157～0.168） −0.148（−0.313～0.018） −0.019（−0.155～0.117）
プラセボとのLSM差、g/gCr −0.154 (−0.416～0.108) −0.025 (−0.264～0.214)
P値 0.32 0.96
1/Crスロープ
スロープ（95% CI）−0.0010（−0.0032～0.0011） −0.0002 (−0.0031～0.0026) 0.0006 (−0.0013～0.0026)
切片 (95% CI)0.684 (0.653～0.716) 0.695 (0.654～0.736) 0.685 (0.657～0.713)
P値* 0.13 0.02
eGFRcrの傾き
傾き（95% CI）−0.060（−0.100 ～ −0.020） −0.011（−0.052 ～ 0.030） 0.010（−0.024 ～ 0.045）
切片 (95% CI)34.5 (32.5～36.5) 35.3 (33.3～37.3) 35.4 (33.8～37.1)
P値* 0.10 0.01
eGFRcysの傾き
傾き（95% CI）−0.033（−0.083～0.018） 0.009（−0.042～0.060） 0.001（−0.042～0.044）
切片（95% CI）37.8（34.1～41.5） 40.4 (36.6～44.1) 42.7 (39.6～45.8)
P値* 0.25 0.31
表2. 主要および副次的エンドポイント。
主要評価項目は、薬剤投与後24週時点におけるベースラインからのISの変化量であった。本表は各評価項目のLSM（最小二乗平均）および95%信頼区間（CI）をまとめたものである。群間比較のP値は以下のように算出された：1/Crの傾きには混合効果モデルを、その他の評価項目にはANCOVAモデルを適用し、その後Dunnettの事後検定を実施した。*P < 0.05。略語：LSM、最小二乗平均；CI、信頼区間；IS、インドキシル硫酸；PS、フェニル硫酸；PCS、p-クレシル硫酸；TMAO、トリメチルアミンN-オキシド；eGFRcr、クレアチニンから算出した推算糸球体濾過量；eGFRcys、シスタチンCから算出した推算糸球体濾過量；Cr、クレアチニン；Cys、シスタチンC； BUN、血中尿素窒素；UPCR、尿中タンパク/クレアチニン比。SI換算：IS→μMは4.69倍、PS→μMは5.77倍、PCS→μMは5.31倍、TMAO→μMは13.3倍。eGFRcr、 eGFRcys、およびEqaveageをml/s/m2に変換するには0.0167を乗じる；CrをμMに変換するには88.4を乗じる；CysをμMに変換するには0.0749を乗じる；BUNをmMに変換するには0.357を乗じる。
*主要および主要な副次的アウトカム（FASを用いた対応する解析）は、治療遵守度に関わらず治療効果を評価した。欠損値はLOCF法を用いて補完した。変数の変化については、研究薬投与開始時の値を共変量、eGFRを割付因子とした共分散分析モデルを用いた （25～35 ml/min/1.73 m2 または 36～45 ml/min/1.73 m2）を比較し、Dunnettの事後検定を実施。1/Crの傾きについては、参加者をランダム効果、治療群・週数・治療×週数を固定効果とする混合効果モデルを適用。
副次的評価項目について、BUN値はプラセボ群と比較して4、12、20、24週で有意に回復し、ルビプロストン16μg群ではベースラインと24週間に有意差が認められた（図3A左、表2）。中等度 （図3A中央、表S2）および重度腎機能障害群（図3A右、表S3）のサブグループ解析では、いずれの群でもBUN値に変化は認められなかった。ルビプロストン群では、クレアチニン（Cr）値はベースラインから24週目まで変化しなかった（図3B左および表2）。中等度（図3B中央および表S2）および重度腎機能障害群（図3B右および および表S3）では、いずれの群でもCr値に変化は認められなかったが、中等度群ではP値0.05（8μg群）および0.06（16μg群）が観察された（表S2）。一方、1/Crの傾きはルビプロストン16μg群で有意に回復した（図3C左）。中等度（図3C中央、表S2）および重度（図3C右、表S3）腎機能障害群のサブグループ解析では、中等度サブグループにおいて8μg群と16μg群の両方で1/Crの傾きが有意に改善した（図3C中央、表S2）。eGFRに関しては、血清Crを基に算出したeGFR（eGFRCr）は、16μg群においてベースラインから24週時点まで有意に維持された（図3D左、表2）。。平均標準化量（LSM）と95%信頼区間（CI）は以下の通りであった：プラセボ群ではLSM：−1.55 ml/min/1.73 m2（95% CI：−2.83～−0.27）、ルビプロストン8μg群ではLSM： −0.34 ml/min/1.73 m2（95% CI: −1.64～0.96）；ルビプロストン16μg群：LSM 0.37 ml/min/1.73 m2（95% CI: −0.70～1.44）。統計的有意性は以下の通りであった：プラセボ対ルビプロストン8μg群、P = 0.32；プラセボ対ルビプロストン16μg群、P = 0.0457。16μg群では、投与8週、12週、16週、20週後のeGFRCr値にも有意な変化が認められた（図3D左）。サブグループ解析では、中等度群において8μg投与群は8、12、16、20、24週でeGFRCrを改善したのに対し、16μg投与群は8、12、16、20週で改善が認められた（図3D中央、表S2）。一方、 重度群ではeGFRCr値に有意差は認められなかった（図3D右、表S3）。さらに、ベースラインから24週時点までのeGFRCrの傾きを分析した。対照群と比較し、16μg群ではeGFRCrの傾きが有意に維持されていた（図3E左、表2）。サブグループ解析では、中等度群においても8μg群と16μg群の両方でeGFRCrの勾配が維持されていた （図3E中央、表S2）。重症群ではeGFR低下抑制に差は認められなかった（図3E右、表S3）。これらの知見は、ルビプロストンが16μg群で腎保護効果を発揮し、8μg群でも同様の傾向が認められるもののその程度は低いことを示している。特筆すべきは、中等度群において8μgおよび16μgの両用量で腎保護効果が認められた点である。これとは対照的に、シスタチンC値 （図S1Aおよび表2）、血清シスタチンCに基づく推算糸球体濾過率（eGFRcys；図3Fおよび表2）、あるいはeGFRcysの勾配（図3Gおよび表2）に変化は認められなかった。さらに、尿中タンパク質レベルはどの時点でも変化せず （図S1Bおよび表2）やいずれの群においても変化は認められなかった（表S2およびS3）。体重減少、尿酸値上昇、B型ナトリウム利尿ペプチド（BNP）値上昇も観察されなかったことから、eGFRの上昇は筋量減少や体液貯留によるものではないと示唆された（図S2）。これらのデータは、ルビプロストンが尿毒症性毒素に影響を与えることなく、特にCKDおよび中等度腎機能障害患者において腎機能低下を抑制することを強く示唆している。各エンドポイントの測定された時間経過は図S3およびS4に示す。
重篤な有害事象
予期された有害事象として、下痢が8μg群の12.1％、16μg群の16％に認められた。有害事象による全中止率は、16μg群で8%、プラセボ群で5.7%、8μg群では0%であった。これらの差は統計学的に有意ではなかった。16μg群で中止した患者中、ルビプロストンとの因果関係が疑われた症例は3例（腹痛1例、下痢1例、めまい1例）（表S4）。16μg群で中止した患者におけるクレアチニン値上昇1例では、 担当医はルビプロストンに対するアレルギー反応を疑い遅延型リンパ球反応検査を実施したが陰性であった。
重篤な有害事象は118例中5例で認められた：プラセボ群3例、ルビプロストン8μg群1例、16μg群1例。ルビプロストン16μg群1例では投与との因果関係が認められた （胃食道逆流症）（表S5）。浸透圧性塩類下剤では、特に心機能障害や慢性腎臓病（CKD）患者において、脱水症状や塩分・電解質レベルの異常が生じる可能性がある 特に心機能障害や慢性腎臓病（CKD）患者において（23）。本研究では下痢症例が報告されたものの、臨床的に意義のある電解質異常は認められず、ルビプロストンがCKD患者に良好な耐容性を示すことを示唆している。
ルビプロストンは微生物叢とポリアミン代謝を調節した
ルビプロストンの腎保護作用機序を解明するため、キャピラリー電気泳動飛行時間型質量分析法 （CE-TOFMS）に基づく標的メタボローム解析、16SリボソームRNA（rRNA）アンプリコンシーケンス、ショットガンメタゲノム解析 （図4A）。ルビプロストン8μg群と16μg群で類似した傾向を示した代謝物、細菌種、微生物酵素遺伝子を解析し、ルビプロストンの用量依存的効果を同定した。代謝物解析により、154 （陰イオン62、陽イオン92）、236（陰イオン87、陽イオン149）、274（陰イオン102、陽イオン172）の代謝物がそれぞれ血漿、尿、糞便で同定された（図4A、図S5、 表S6）。血漿中では、ルビプロストンは4-アセチル酪酸を増加させ、α-アミノアジピン酸、トランス-アコニテート、乳酸を減少させた。トランス-アコニテートは腎臓で蓄積することが知られている（24）ため、これらの変化はルビプロストンがeGFRを維持することで腎保護効果を示すことを実証している。糞便中では、ルビプロストンは乳酸を増加させると同時に、4-ピリドキサート、N-ε-アセチルリジン、オルニチンを減少させた。ポリアミン前駆体であるオルニチンは、オルニチン脱炭酸酵素によってプトレシン（PUT）に変換される (25)。したがって、オルニチンレベルの減少は、糞便中のポリアミン合成が加速したことを示している。続いて、16S rRNAシーケンシングおよびショットガンメタゲノミクスを用いて、ルビプロストンに反応する細菌種を同定するための分類学的解析を実施した（図4A、図S6、表S7）。16S rRNA解析では270属が同定されたのに対し、ショットガンメタゲノム解析では3780種が同定された。このうち、5属が16S rRNA解析で変動を示し、9種がショットガンメタゲノム解析で変化した。16S rRNA解析では、Marvinbryantia、Roseburia、Coprococcus 3、およびLachnospiraceae UCG-004が増加した一方、 一方、ルビプロストン投与後にはDesulfovibrioが減少した（図4A）。ショットガンメタゲノム解析では、Murimonas intestini、Senegalimassilia anaerobia、Blautia stercoris（未分類）、Slackia heliotrinireducens、Ruminococcus gauvreauii、Marvinbryantia formatexigens、Streptococcus cristatus、 Actinomyces vaccimaxillae、Pectobacterium cacticidaは増加した一方、Bacteroides gallinarum、Clostridium perfringens、Bacteroides stercorisは減少した（図4A）。短鎖脂肪酸を産生し、糖尿病などの疾患と関連するBlautia、Roseburia（26）、 およびMarvinbryantia（27）は、短鎖脂肪酸を産生し、糖尿病などの疾患と関連しており、ヒトの健康に有益な細菌として認識されている（28）。BlautiaはさらにS-アデノシルメチオニン、アセチルコリン、オルニチンも産生する（29）。これらの知見は、ルビプロストン投与に対する反応として、微生物叢の変化と代謝産物の調節が生じていることを示唆している。
図4. マルチオミクス解析。
解析対象は、治療前後の便サンプルを両方とも提供した患者のみとした （プラセボ：13例、14μg：8例、16μg：19例）。より高い有効性に焦点を当てるため、プラセボ群とルビプロストン16μg/日群をさらに反応者群（プラセボ：7例、16μg：9例）と非反応者群（プラセボ：6例、16μg：10例）に分類した。(A および B) メタボロミクス、16S rRNA、ショットガンメタゲノミクス（系統学的および機能的）を統合したヒートマップは、方法の詳細に記載された基準を満たす項目を示す。[(A) 三群比較解析；(B) 反応群/非反応群]。色は群平均のzスコアを示す。項目はP値の昇順で並べ替えられ、増加した項目が最初に表示される。機能解析では、増加した上位12項目（A）または13項目（B）を示す。重要なKOであるaguAは太字で強調。 (C) バープロットは、効果サイズの降順で並べ替えられた、著しい変化を示した分類群（ALDEx2）を示す。箱ひげ図横の記号は、各属内のKEGG登録株におけるaguAの存在を示す：「+」（存在）、「−」（欠如のみ）、「？」（データなし）。(D) ショットガンメタゲノミクスによるaguAの相対存在量（左：3群比較、右：反応者解析）。同一参加者を線で結ぶ。ウィルコクソン符号付順位検定を実施。(E) aguAを含むポリアミン生合成経路の模式図。(F) 治療前後の血漿中ポリアミン（PUT、SPD、SPM）の箱ひげ図。主要評価項目と同様に、ベースラインからの変化はANCOVAで比較した。*P < 0.05, **P < 0.01。speA: アルギニン脱炭酸酵素; speB: アグマチン分解酵素; speC、オルニチン脱炭酸酵素；speE、スペルミジン合成酵素；aguA、アグマチン脱イミナーゼ；aguB、N-カルバモイルプトレシンアミダーゼ；rocF、arg、アルギナーゼ； SMS、スペルミン合成酵素；PUT、プトレシン；SPD、スペルミジン；SPM、スペルミン。
ショットガンメタゲノミクスを用いた糞便微生物叢の機能解析により、6396のKEGGオルソログ（KO）が同定され、そのうち53がルビプロストンにより有意に変化した。上位12のKOを示す（図4A、 図S7、表S8）。これには水素酵素4構成要素J（hyfJ）、水素酵素4構成要素H（hyfH）、水素酵素4構成要素C（hyfC）、および水素酵素3成熟プロテアーゼ（hycl）が含まれる。Hyfは推定プロトン輸送型ギ酸水素化酵素システムをコードする（30）。水素代謝は微生物の成長・生存に広く利用されるエネルギー源である（31）。一方、アグマチン脱イミダシン酵素（aguA）はポリアミン生合成に関与する酵素である。ポリアミンはオートファジーを介した抗炎症作用を発揮する（32）。（31）であり、微生物の増殖と生存に広く利用されるエネルギー源である（32）。一方、アグマチンデイミナーゼ（aguA）はポリアミン生合成に関与する酵素である。ポリアミンはオートファジーとミトコンドリア維持を介して抗炎症作用を発揮する（33）。これらのデータは、ルビプロストンがCKD患者において腸内微生物叢の変化を促進し、ポリアミンおよび短鎖脂肪酸代謝物を調節することを示している。
なぜルビプロストンは特定の症例では有効性を示すが、他の症例では示さないのか？
我々の臨床試験の結果に基づき、16μgルビプロストン治療群内においても、治療に効果的に反応した患者サブグループと、実質的な治療効果を示さなかった患者サブグループが存在することに留意した。ルビプロストンの腎保護効果をさらに探るため、16μgルビプロストン群の参加者をeGFR改善度に基づき反応群（n = 9）と非反応群（n = 10）に分類した。これらの群を対照群と比較するため、糞便サンプルを含む全ての付随データセットを用いた（図S8および表S9）。各群間で年齢、性別、体重、ベースラインeGFRに顕著な偏りは認められなかった。腎硬化症は反応群でより多く認められた（プラセボ群23.1％、反応群66.7％、非反応群20％）。一方、糖尿病性腎症は非反応群でより多く認められた（プラセボ群7.7％、反応群0％、 非反応群30％）でより高頻度であった。ARB/ACE阻害薬、SGLT2阻害薬、GLP1アゴニスト、MR拮抗薬の使用率に群間差は認められなかった（表S9）。
CE-TOFMSを用いた代謝物解析により、血漿中ジエタノールアミン濃度の上昇が確認された（図4B、図 S9A、表S10）。一方、α-アミノアジピン酸、クレアチニン、尿酸、リジン、対称性ジメチルアルギニン、バリン、γ-ブチロベタインのレベルは低下した（図4B、図S9B、表S10）。。Cr、尿酸、対称性ジメチルアルギニン、γ-ブチロベタイン（RFで蓄積することが知られている化合物24, 34）の減少は、ルビプロストンがレスポンダー群の腎機能を改善したことを裏付ける。尿中では、2,3-ピリジンジカルボン酸塩レベルが上昇した（図4B、図S9C、表S10）。初期解析（図4A）と同様に、反応群の糞便中では乳酸レベルが上昇した（図4B、図S9D、表S10）。
16S rRNA解析では、Holdemaniaのみが有意な減少を示した（図4B、図S10A、表S11）。ショットガンメタゲノム解析では、Blautia stercoris（未分類）、Roseburia inulinivorans、Anaerosporobacter mobilis、Bacteroides salyersiae、Streptococcus lactarius、Clostridium vincentii、Akkermansia muciniphila、Streptococcus parasanguinisが増加した一方、B. gallinarumは減少した（図4B、 図S10B、表S11）。Holdemaniaは炎症反応に関与し、神経疾患と関連している（35）。反応群で増加したBlautia、Roseburia、Akkermansiaは、短鎖脂肪酸を産生する有益な細菌である（26、28、36）。ショットガンメタゲノミクスを用いた機能解析により、反応群では23のKO（遺伝子欠損株）の豊富度が減少した一方、3つのKOでは増加したことが示された（図4B、図S11、表S12）。。図4Aに示す初期解析と同様に、aguAは有意に増加した一方、2-デヒドロ-3-デオキシホスホグルコン酸アルドラーゼ（eda）は減少を示した（図4B）。
ルビプロストン投与がポリアミンおよびaguA経路に関連している可能性という知見に基づき、反応群の腸内微生物叢の構成を再分析した（図4Cおよび表S13）。16S rRNAを用いたALDEx2解析（37）により、Roseburia、Odoribacter、Tannerellaceae;g__NA、Ruminococcus、Gordonibacter、Actinomyces、Fusicatenibacter、Streptococcus、Lachnospiraceae;g__NA、 Adlercreutzia、Blautia、Intestinibacter、Prevotella_9は増加した一方、Holdemania、Colidextribacter、Family XIII UCG-001、Agathobacter、Flavonifractor、GCA-900066575、Veillonella、Raoultibacter、Prevotellaceae;g__NAは減少した。ルビプロストンにより増加した13属のうち、Roseburia、Ruminococcus、Gordonibacter、Streptococcus、Adlercreutzia、およびBlautiaはaguAを保有していることが判明した（図4C、+で示され、表S13）。これらの細菌の増加が総合的にaguAの上昇に寄与し、ポリアミンの増加につながった。
そこで、糞便中のaguA発現量を測定した（図4D）。初期臨床試験において、16μg群では糞便中のaguA遺伝子発現が増加し、8μg群でも糞便中のaguA増加傾向が認められた（図4D左）。レスポンダー対ノンレスポンダー解析においても、16μg群ではaguA遺伝子便中発現が増加し、8μg群でも同様の傾向が認められた （図4D右）。これらの結果は、ルビプロストンの腎保護効果においてポリアミン経路が重要な役割を果たすことを強く示唆している。aguAは、アルギニンからアグマチンを経由してPUTを合成する同経路内の代謝酵素である（図4E）。ヒトでは、ポリアミンは食事由来だけでなく、腸内細菌叢によって合成され、吸収され、体内で利用される (38)。我々は最近、ガスクロマトグラフィー-タンデム質量分析法（GC-MS/MS）を用いたPUT、スペルミジン（SPD）、スペルミン（SPM）の濃度を定量する高感度法を開発した (38)。そこで血漿および糞便中のポリアミン濃度を測定した（図4Fおよび図S12）。ポリアミンの中で、血漿SPD濃度はプラセボ群に比べ反応群で高値を示した（図4Fおよび図S12A）。一方、血漿PUTおよびSPM濃度は変化しなかった。糞便中では、レスポンダー群においてSPDは変化しなかった（図S12B）が、SPMレベルは増加した。aguAはアルギニンおよびアグマチンを介したポリアミン合成経路に関与する酵素であるため、これらの結果は、ルビプロストンが糞便中のaguA含有細菌叢を増加させ、ポリアミン産生を促進することで腎保護効果を発揮する可能性を強く示唆している。
SPDはミトコンドリア機能回復により腎機能を改善
SPDはミトコンドリア機能を強化し、ヒトにおける心血管死や癌関連死亡率の低減（39）など、様々な臓器保護効果を示す（33）。SPD濃度上昇によるミトコンドリア機能調節を介したルビプロストンの腎機能改善作用を検証するため、アデニン誘発性腎症（RF）マウスにSPDを経口投与し、腎ミトコンドリア機能を解析した（図5A）。RF群と比較して、RF + SPD群ではクレアチニン値の改善が認められた（図5B）。組織学的には、RF群で観察された尿細管面積の減少がSPD群で有意に回復した（図5C）。GDF15はミトコンドリア疾患（40）だけでなく、慢性心不全（41）や加齢（42）の診断にも用いられる循環バイオマーカーである。RF群では対照群よりGDF15レベルが高く、ミトコンドリア機能障害を示していた。この条件下で、RF群の上昇したGDF15レベルはSPDにより有意に低下した（図5D）。これらのデータは、RFマウスへのSPD投与がミトコンドリア機能障害を改善することで腎機能を向上させることを示している。さらに、アデニン誘発性RFにおいてSPDがミトコンドリア形態を保持するかどうかを調査するため、スピニングディスク共焦点技術（SoRaイメージング）を用いて近位尿細管内の三次元（3D）ミトコンドリア構造の画像解析を実施した（図5E）（43, 44）。その結果、ミトコンドリア総体積（視野内のミトコンドリア総体積を近位尿細管細胞核数で除した値）はRFマウスで減少しており、SPD投与によりその減少が抑制された。さらに、連続ネットワークの割合はRFマウスで減少したが、SPD投与RFマウスでは維持されていた。球形度で定義される断片化はRFマウス腎臓で進行しており、その結果、間欠的形態がRF群で増加していた。しかしながら、ミトコンドリア損傷はSPD投与により回復した。
図5. アデニン誘導RFマウスへのポリアミン経口投与もRFの改善を示した。
(A) プロトコル図。SPD（3 mM）を飲水経由で投与。(B) 血漿クレアチニン。(C) 腎皮質のH&E染色およびMT染色。MT染色した皮質全体における尿細管領域を定量。スケールバー、100 μm。(D) 血漿GDF15濃度。(E) COX IV染色ミトコンドリアのSoRaイメージング。代表的な最大強度投影像およびミトコンドリア体積、ネットワーク、中間体、断片化の特徴の定量化。スケールバー、5 μm。(F～H) 腎組織のRNA-seq解析。(F) 3群（対照群、RF群、SPD群）を比較した主成分分析（PCA）。(G) RFで上調節されSPDで下調節される遺伝子のベン図、ヒートマップ、およびエンリッチメント解析。(H) RFで下調節されSPDで回復する遺伝子のベン図およびエンリッチメント解析。このセット内のミトコンドリア関連遺伝子を強調したヒートマップ。統計検定：(B)および(D)には一元配置分散分析（ANOVA）とTukey検定を適用； (E) についてはクルスカル・ウォリス検定とダン検定。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。[(A) から (E)] 対照群 (Ctrl), n = 6; RF, n = 6; RF + SPD, n = 7。[(F)から(H)] 対照群 (Ctrl), n = 6; RF, n = 5; RF + SPD, n = 5. H&E, ヘマトキシリン・エオジン染色; MT, マッソン・トリクローム染色; RF, 腎不全; SPD, スペルミジン; COX, シトクロムcオキシダーゼ; Ctrl, 対照; Lubi, ルビプロストン。
マウスにおけるこれらのin vivo所見に続き、我々は細胞フラックスアナライザーを用いてin vitroでSPDがミトコンドリアの生体エネルギー代謝を変化させるかどうかを調査した（45）。ヒト近位尿細管細胞HK-2細胞を用いて、SPDがミトコンドリアの生体エネルギー代謝に及ぼす影響を評価した（図S13）。SPD曝露は、基礎および最大ミトコンドリア呼吸量ならびに呼吸余剰量（SRC）の増加をもたらした。アデノシン5'-三リン酸（ATP）産生の増加も観察された。さらに、解糖活性の上昇も確認された。これはSPDが解糖経路を介したエネルギー産生も促進する可能性を示唆している。我々の知見は、SPD曝露がミトコンドリア呼吸機能の全体的な増強をもたらすことを実証した。さらに、これらのデータは、RF中のSPDレベル増加が腎臓におけるミトコンドリア機能の維持に寄与し、腎機能回復に貢献することを示唆している。
RNAシーケンス
ミトコンドリア障害および腎障害に対するSPDの保護効果をさらに確認するため、腎臓のRNAシーケンス（RNA-seq）を実施した。主成分分析により、各群間、特にRF群とRF + SPD群間でRNA発現プロファイルに明らかな差異が認められた（図5F）。RF群で発現が上昇し、RF + SPD群で発現が低下した遺伝子に焦点を当てたところ、50個の遺伝子が同定された［基準：RF対対照群、偽発見率（FDR）＜0.01、対数倍変化量（FC）＞1；RF + SPD対RF群、FDR＜0.01、対数FC＜−1］（図5G左）。これら50遺伝子のエンリッチメント解析により、「サイトカインおよび炎症反応」に関連する経路の有意な発現が示された（図5G右）。ミトコンドリアが損傷すると、ミトコンドリア膜電位（MMP）の低下に伴いミトコンドリアDNAが細胞質へ放出される。さらに、ミトコンドリアDNAはcGAS-STING経路（46）またはNLRP3経路（47, 48）を活性化し得る。この文脈において、SPDによるミトコンドリアストレスの軽減は、RF腎におけるサイトカインおよび炎症反応を緩和した。RF群で発現が低下し、RF + SPD群で発現が上昇した遺伝子に焦点を当てた結果、70個の遺伝子が同定された（RF対対照群：log FC < 0かつFDR < 1 × 10−15；RF + SPD対RF群：log FC > 0かつFDR < 0.005）（図5H左）。これら70遺伝子のエンリッチメント解析により、ミトコンドリアマトリックスにおける有意な発現が示され、これはRFにより最も顕著に減少した経路であり、SPDにより改善された（図5H右）。ミトコンドリア由来RNAの詳細な解析では、酸化リン酸化（OXPHOS）構成要素（ND2–6、ATP6、ATP8、COX1–3、 およびCytb）でも同様の挙動が確認され、RF群では発現が低下し、RF + SPD群では発現が上昇した（図5H中央）。これらの知見は、SPDが腎機能障害によるミトコンドリア損傷を緩和し炎症を抑制することで、ミトコンドリア機能を維持し腎機能を改善することを示唆している。
考察
これまで、CKDにおける心血管イベントの予後および発生率と相関する腸管由来尿毒症性毒素（IS、PCS、TMAO）の同定と特性評価に焦点を当てた研究が主流であった（49–51）。活性炭AST120の経口投与は、腸管内でトリプトファンやインドールを吸着することでISなどの血中尿毒症毒素を減少させる。しかし米国と韓国での臨床試験では腎機能改善というエンドポイントを達成できなかった[EPPIC（52, 53）およびK-STAR（54）]。したがって我々は、尿毒症性毒素と腎機能の関係に関する従来の理解を再考した。長い結腸通過時間は微生物多様性の高さと関連し、結腸代謝が炭水化物発酵からタンパク質異化へ移行することを伴う（13）。これにより便秘時にトリプトファンやフェノール代謝物が蓄積する。逆に、結腸通過時間の短縮は、結腸粘膜の再生増加を反映する可能性のある代謝物と相関している（13）。したがって、結腸通過時間を延長することで腎機能の低下を抑制できる可能性がある。さらに、我々の動物研究では、ルビプロストン（18）およびリナクロチド（19）が血中尿毒症毒素レベルを低下させ、腎機能を改善することが実証されている。これらの知見に基づき、尿毒症性毒素レベルの低下および／または結腸通過時間の短縮がCKD患者の腎機能を維持するとの仮説を立て、ヒト臨床試験を実施した。
本研究は、ルビプロストンが尿毒症性毒素に依存しない腎保護効果を発揮することを実証しており、これはヒト腸内細菌叢が産生するSPDを介したミトコンドリア機能の増強に起因する可能性がある (図6)。PUTやSPDなどのポリアミンは、オートファジーを促進し炎症を抑制する生物活性化合物であり、細胞保護および臓器保護効果を発揮する(55)。さらにSPDは、加齢誘導多能性幹細胞(iPSC)由来ニューロンにおいてATP産生を促進し、MMPを増加させ、活性酸素種を減少させ、ミトコンドリア呼吸を改善する(56)。また大動脈弁石灰化を軽減する(57)。さらに、ミトコンドリアの生体エネルギー機能に関する我々の知見を踏まえると、SRCの増加が認められたことは特に臨床的・生理学的に意義深い。SRCはミトコンドリア予備能を評価する極めて堅牢な機能パラメータであり、その増加は代謝ストレスへの細胞応答能力の増強を示唆する可能性がある（58）。また、SPDはミトコンドリア断片化によって活性化されるNLRP3炎症小体を減少させることで急性腎障害を保護することが報告されている（59）。これらの知見は、SPDがこの重要な生体エネルギーパラメーターを正に調節し、それによって代謝ストレスや酸化ストレスに対する細胞の適応能力を高め、炎症を軽減する可能性を示唆している。
図6. ルビプロストン-腸-腎軸を介したポリアミンによる腎保護作用。
これはルビプロストン投与による腎機能改善を示す模式モデルである。ルビプロストン投与は腸内細菌叢を変化させ、アグマチンデイミナーゼ（aguA）が増加する。宿主血中のポリアミン濃度が上昇し、これがミトコンドリア保護効果を発揮するとともに腎臓の炎症を抑制し、RFの進行を防止する。BioRenderで作成。Abe, T. (2025) https://BioRender.com/51t2iwg.
対照群では研究期間中にSPDレベルが低下したのに対し、レスポンダー群ではルビプロストン投与後もSPDレベルの有意な低下は認められなかった（図S12）。これらの知見は、ルビプロストンがSPDレベルの低下を抑制する可能性を示唆している。SPD関連メカニズムに加え、ルビプロストンの効果を説明する他の可能性が考えられる。第一に、ルビプロストンは腎臓の塩化物チャネルに直接作用する可能性がある。電圧依存性塩化物チャネルCLCN2は、腸管だけでなく脳、肺、腎臓にも広く発現している（60）。したがって、電気化学的勾配に不可欠なCLCN2活性の増強は、報告されているように（61）、イオンバランスの是正と腎機能改善に寄与する可能性がある。第二に、腎保護効果は、循環系で主に検出される活性代謝物M3に部分的に起因する可能性がある（62）。最近、我々は別の無作為化プラセボ対照臨床試験（38）を実施し、ヒトにおいてアルギニンを添加したビフィドバクテリウムが血清PUT、SPD、および糞便中PUTを増加させ、それによって血管内皮機能を強化することを発見した（38）。SPDはeEF5/EIF5Aのヒプシネーションを強化し、クエン酸回路および酸化的リン酸化に関与するミトコンドリアタンパク質サブセットの効率的な発現を促進する（63）さらにSPDは、炎症小体およびインターロイキン-1β産生を抑制することで敗血症誘発性急性腎障害を防御する（59）。これらの知見は、ルビプロストンが尿毒症性毒素とは独立したポリアミン-ミトコンドリア軸を介して腎機能を保護することを示唆している。
我々はIS減少を主要評価項目とし、eGFR・BUN・尿中タンパク質の抑制を副次評価項目とした。この評価項目設計は、血清ISレベル≥0.3 mg/dlの患者が＜0.3 mg/dlの患者よりCKD進行が有意に速いとの報告に基づく（64）。しかし本研究では、予想外にもISレベルの変化幅は1.91～2.41 mg/ml（約0.2 mg/dlの変化に相当）であり、ルビプロストンの効果を有効に評価するには低すぎる値であった。したがって、予想を下回る変動幅のため、ルビプロストンがIS値に及ぼす影響を決定的に評価することはできなかった。逆に、ルビプロストンが腎パラメータを保護することが判明し、その腎保護作用が尿毒症性毒素とは独立していることを示唆した。薬理学的効果をさらに解明するため、参加者を反応群と非反応群に層別化し比較分析を行った。レスポンダー群とノンレスポンダー群の代謝プロファイルおよびメタゲノムプロファイルのベースライン比較により、いくつかの相違点が明らかになった（表S14～S17）。具体的には、血漿尿酸、糞便中Holdemania、およびaguAが、レスポンダー群特有の変化を示す特徴として同定された。尿酸およびHoldemaniaレベルは、レスポンダー群でベースライン時より高く、ルビプロストン投与後に減少した。この顕著な減少は、初期値が高かったことに起因する可能性がある。一方、aguAもレスポンダー群でベースライン時より高かったが、ルビプロストン治療後にさらに増加した。これはレスポンダー群の腸内細菌叢が比較的aguAを豊富に含むことを示唆している。このルビプロストンによるaguAの増強が、本群で観察された腎保護効果に寄与した可能性がある。加えて、ルビプロストンの効果を予測する代替マーカーが必要である。この観点から、血漿尿酸、糞便中Holdemania、および糞便中aguAは、患者におけるルビプロストンの有効性を検出・評価する可能性のあるマーカーである（表S14～S17）。これらの知見を検証するには、さらなる臨床試験が必要である。
eGFRCr または eGFRcys
本臨床試験では、ルビプロストンはeGFRCrを改善したが、eGFRcysは改善しなかった。eGFRCrとeGFRcysの結果の相違の原因を明らかにし、CKD患者におけるルビプロストンが腎機能に及ぼす影響を評価する必要がある。本試験では、体重、尿酸、BNPレベルの減少は認められず、eGFRCrレベルの増加は筋量減少や希釈の結果ではないことを示している（図S2）。複数の研究で、Cr値とシスタチンC値に基づくeGFRの差異が報告されている（65）。腎機能推定の精度不足を補うため、GFR推定式（CKD-EPICr-cys）にCrとシスタチンCを併用することで精度向上が提案されている（66）。ただし、これらの式では人種の影響も考慮されている（67）。解決策として、日本人集団においてeGFRが30～59 ml/min/1.73 m2の群において、CKD-EPICr-cysと比較して予測精度が有意に改善されたことを示した、日本人係数修正CKD-EPI式（Eqaverage）が提案されている（68, 69）。しかし、eGFRCrとEqaverageに登録された集団が異なっていたため、Eqaverageを用いた集団比較（図S14A）やEqaverageの傾き（図S14B）の比較では有意差はほとんど認められなかった。これらの知見に基づき、登録患者を再評価したところ、eGFRを再計算した参加者の約10％が25～45の範囲外であり、除外された（再解析プラセボ群：n = 28；再解析ルビプロストン8μg群：n = 22；再解析ルビプロストン16μg群：n = 42；図S14C）。。ルビプロストン8μg群では投与20週後、16μg群では20週および24週後にeGFRにおけるEqaverageの有意な変化が認められた（図S14D右）。。サブグループ解析では、中等度群において16μg群でもEqaverageが維持されていた（図S14D中央）。しかし重度群ではEqaverageに有意差は認められなかった（図S14D）。さらに、Eqaverageの傾きは8μg群および16μg群で維持されていた（図S14E左）。サブグループ解析では、中等度群において、8μg群では12週間投与後にEqaverageの低下が抑制され、16μg群では8、12、16、20、24週間後に有意に抑制された（図S14E、中央）。重症群では、Eqaverageの傾きに差は認められなかった（図S14E右）。したがって、腎機能を推定する際には、これらの2つのパラメータを用いて解離の特徴と要因を理解することが重要である。
限界
介入期間と患者数に関して、臨床研究期間は比較的短く、患者数は比較的少なかった。一方、Levey ら (70) は、eGFR の年率変化が 0.5～1.0 ml/min/1.73 m2 または尿中アルブミン・クレアチニン比 (UACR) が 30% 減少すれば、CKD 進行を評価する臨床試験における代替エンドポイントの基準を満たすと報告している。本研究では、 プラセボ群の24週間におけるeGFR変化量は−3.36 ml/min/1.73 m2/年、ルビプロストン16μg群は0.8 ml/min/1.73 m2/年であり、差は約4 ml/min/1.73 m2/年となり、彼らの基準を満たしている。本試験の基準及び患者数は、探索的臨床試験として日本の医薬品医療機器総合機構により承認された。本試験で観察された腎保護効果は副次的・探索的エンドポイントであるため、結果の解釈には注意が必要である。包括的な評価のために、第2相試験でも複数のエンドポイントを使用することができます。FDAのガイドライン（https://fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/multiple-endpoints-clinical-trials-guidance-industry）によれば、ISやeGFRなどの複数のエンドポイントを取り入れることを検討すべきです。Coresh et al. (71) は、eGFRの30％超の低下はCKD進行の臨床的に意義ある指標であり、末期腎疾患および死亡リスクの増加と関連すると報告している。今後の臨床試験では、ルビプロストンの腎保護効果をより包括的に評価できるよう、これらの基準を試験設計に組み込むべきである。我々はCKD患者におけるルビプロストンの作用機序を解明するため、マルチオミクス解析を実施した。オミクス情報の信頼性は、効果量、試験サンプルサイズ、交絡因子の影響度合いによって左右されることが多い（72）。バッチ効果や技術的変動性も結果に影響を与えた。さらに、オミクスおよびマルチオミクス解析では数千もの統計的検定が行われることが多く、ノイズや偶然による偽陽性検出の深刻なリスクが存在する（73）。この結果は慎重に解釈すべきであり、検証コホート研究が必要である。また、登録患者全員が日本人（アジア人）であった点も指摘した。これは他の民族集団やより広範なCKD患者集団への一般化可能性を制限する。追加のレスポンダー解析では血漿SPDの増加が示されたが、その臨床的意義は予備的かつ不明確であり、サンプルサイズが小さいためこの結果への信頼性は低い。したがって、ルビプロストンによるCKD治療の有効性を検証するには、より長期・大規模な臨床試験および異なる人種集団の参加が必要である。
ルビプロストンはミトコンドリア機能を調節することで腎機能を改善する、これまで知られていなかったCKD治療薬である。CKD治療の第一の目的は、尿毒症性毒素やタンパク尿/アルブミン尿といった代替マーカーではなく、腎機能そのものの改善にある。したがって、腎機能改善に焦点を当てたルビプロストンの今後の試験が不可欠である。
方法
研究デザイン
本試験は多施設共同、無作為化、二重盲検、プラセボ対照試験である。方法、実施、解析については補足プロトコルおよび統計解析に記載されている。試験は研究者により設計・実施され、東北大学病院臨床研究センターの支援を受けた。資金提供機関である医療研究開発機構（AMED）は本試験の設計・実施に関与していない。全著者はデータの完全性・正確性、ならびに試験プロトコルへの忠実性を保証する。本試験は臨床試験登録（UMIN000023850）に登録され、プロトコルは東北大学倫理委員会（承認番号：2013-2-196-1、2018-2-239）の倫理承認を得た。研究参加前に、研究の目的、手順、潜在的なリスクと利益、およびいつでも脱退できる権利について十分な説明を行った後、全参加者から書面によるインフォームドコンセントを取得した。
試験実施施設と参加者
参加者は2016年7月から2019年12月にかけて、日本の9施設から募集された： 東北大学、東京慈恵会医科大学、JCHO仙台病院、虎ノ門病院、福島県立医科大学、秋田大学、千葉大学、順天堂大学、山形大学。スクリーニング期間中（3ヶ月以上）に持続的な推定糸球体濾過量（eGFR）25～45 ml/min/1.73 m2を示した20歳以上の慢性腎臓病（CKD）患者を対象とした。患者適格基準は表S18にまとめた。試験参加に関する書面による同意は、全参加者または判断能力のない場合はその親族から取得した。免疫抑制剤、経口吸着剤、下剤、腸管調節剤の使用患者、進行性タンパク尿、急性腎炎、薬剤性腎障害、既往腎移植歴のある患者は除外した（表S19）。
無作為化と試験介入
ベースラインeGFR値に基づき、患者をプラセボ群、ルビプロストン8μg/日群、ルビプロストン16μg/日群に2:2:3の比率で層別化し、群間評価におけるeGFRの影響を均等化した。患者と試験薬の無作為化順序は作成され、非盲検試験薬割付管理者が管理した。治療割付の盲検化を維持するため、患者はルビプロストン8μgを1日1回または2回投与、もしくは同一包装のプラセボを投与された。この投与法は24週間経口投与された（8μg/日群は朝にルビプロストン、夕方にプラセボを投与）。血液検査および尿検査は薬剤投与開始時、その後4週間および8週間間隔で実施された。重篤な有害事象の発生、同意の撤回、または治験責任医師による治療中止の判断がない限り、24週間治療を継続した。
主要評価項目
主要評価項目は、投薬開始時からの24週間後のIS値の変化であった。副次的評価項目には、腸内細菌叢によって生成される血漿尿毒症毒素（ （IS、PS、PCS、TMAO）、腎機能（BUN、Cr、シスタチンC、CrまたはシスタチンCで推定したeGFR、尿中タンパク/Cr比、薬剤投与開始からのCrの逆数の傾き）、排便頻度、ブリストル便形状分類および呼気ガス因子の変化（74）。安全性評価には、試験薬投与開始から最終投与後までの有害事象（AE）のモニタリングが含まれ、AEの重篤度は米国国立衛生研究所共通有害事象用語基準（NCI CTCAE）v.5.0に基づいて評価された。
評価と解釈
ルビプロストンが尿毒症性毒素に及ぼす影響を検討するため、CKD患者を対象とした小規模な3ヶ月間のパイロット臨床試験が実施された（東北大学倫理委員会 #2014 -2-92）。ルビプロストン24μg/日投与でIS濃度が平均−0.24mg/dl変化したことから、8μg/日および16μg/日投与ではそれぞれ−0.08mg/dlおよび−0.16mg/dlの変化を想定した。CKDステージIIIにおける血中IS濃度の標準偏差は0.19mg/dlであり、 変化量の標準偏差はこれより大きいと仮定し、変化量の標準偏差の約1.7倍に相当する0.33 mg/dlを変化量の標準偏差と仮定した。これらの仮定に基づき、主要評価項目解析における多重比較を回避するためボンフェローニ法を用いた。プラセボ群および各投与群の検定の有意水準は、検出力80%で両側検定の場合2.5%に設定し、その結果、各群32名の患者が必要となった。脱落・中断を考慮し各群40例と設定したが、特に下痢などの有害事象による追加脱落を回避するため、16μg/日投与群にはさらに20例を追加した（n = 60）。加えて、 日本のGonryo CKD研究（2692例）に基づき、eGFR低下が検出可能な期間を6ヶ月と設定した（75, 76）。プラセボ群で1例が22週目に治療を中止したが、24週目（事前定義された最終評価時点）のデータは有効と判断され、有効性解析において「完全治療」としてカウントした。
臨床試験の統計解析
各治療群について、主要評価項目・副次評価項目の要約統計量および平均値の95%信頼区間を算出した。ルビプロストン各用量群とプラセボ群のベースラインからの変化量を比較するため、共分散分析（ANCOVA）により最尤平均（LSM）と95%信頼区間を算出した。（ANCOVA）により、ルビプロストン投与開始時の値を共変量、eGFRを割付因子（25～35 ml/min/1.73 m2 または 36～45 ml/min/1.73 m2）として算出した。比較には多重比較を補正するためDunnett法を採用した。欠測データは最終観察値を転記法で補完した。解析対象集団はFAS（主要評価項目が少なくとも1回測定された参加者集団）とした。追加解析として、各測定時点におけるプラセボ群とルビプロストン群のベースラインからの変化量を比較した。解析対象集団はプロトコル順守集団で定義した。これらの解析は探索的であるため、群間比較にはダンネット法を用いたが、測定の多重性は考慮しなかった。試験薬投与開始後の血清クレアチニン値の逆数を、被験者を変数効果、治療群、各評価時点、治療群×各評価時点を固定効果とする混合効果モデルで解析し、3群それぞれの傾きを比較した。各評価時点における実測値の平均値、 試験薬投与開始からの変化量、および変化率について、平均値の要約統計量と95%信頼区間を算出した。安全性解析は、試験薬を少なくとも1回投与された被験者集団（SAS）を対象に実施した。有害事象名はMedDRA（医薬品規制用語集）を用いてコード化し、有害事象、重篤な有害事象（SAE）、試験治療中止を招いた有害事象、有害反応、重篤な有害反応、試験治療中止を招いた有害反応の発生を投与群別に集計した。検定の有意水準はP < 0.05に設定した。統計解析はSAS、R v4.2.1（https://r-project.org/）、Graph Pad Prism v10.0.3（GraphPad Software）を用いて実施した。
メタボロミクスデータ解析
CE-TOFMSによる荷電代謝物の定量解析は、既報の方法（20, 77）に従って実施した。血漿、尿、糞便中の代謝物は、内部標準物質としてメチオニンスルホンおよびD-カンフォール10-スルホン酸を各20μM含有するメタノールで激しく振盪して抽出した。全てのCE-TOFMS実験は、Agilent CEキャピラリー電気泳動システム（Agilent Technologies, Palo Alto, CA）、Agilent G3250AA LC/MSD TOFシステム（Agilent Technologies）、Agilent 1100シリーズ二元高性能液体クロマトグラフィーポンプ、G1603A Agilent CE-MSアダプター、およびG1607A Agilent CE-ESI-MSスプレーヤーキットを用いて実施した。CE-TOFMSデータの主成分分析は、SIMCA 13.0 （Umetrics社、ウメオ、スウェーデン）を用いて実施した。解析にあたっては、検出限界以下の濃度はゼロで置き換え、全検体で検出限界を下回った代謝物は除外した。
さらに、各解析において以下の基準を満たす物質を抽出し、ルビプロストンに対する用量依存的応答を評価した：
1) 治療前後（前＝0週、後＝24週）における物質変化のP値をウィルコクソン符号順位検定で算出。
2) ルビプロストン16μg群：P＜0.05（ショットガン解析）、P＜0.1（メタボローム解析および16S rRNAシーケンシング解析）。
3) ルビプロストン8μg群：P < 0.3かつ16μg群と同方向（正または負）の変化。
4) プラセボ群：P ≥ 0.3または16μg群と逆方向（正または負）の変化。
16S rRNAシークエンシング解析
糞便DNA抽出
糞便DNAの分離は、既報の方法に若干の修正を加えて実施した。各凍結乾燥糞便サンプルに、3.0 mmジルコニアビーズ4個、0.1 mmジルコニア/シリカビーズ約100 mg、DNA抽出バッファー[1% (w/v) SDS含有TE] 400 μl、 およびフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25:24:1）400μlを加え、シェイクマスターを用いて激しく振盪した（1500rpmで15分間）。（バイオメディカルサイエンス、東京都新宿区）を用いて激しく振盪した。得られたエマルジョンを室温で17,800g、10分間遠心分離し、水相から標準的なフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール法（78）により細菌ゲノムDNAを精製した。サンプル中のRNAはリボヌクレアーゼA処理により消化した。得られたDNAサンプルは、再度フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール処理により精製した。
16S rRNA遺伝子シークエンシング
糞便微生物叢DNAサンプル中の16S rRNA遺伝子は、Miseqシーケンサー（Illumina社、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて解析した。16S rRNA遺伝子のV1–V2領域は、オーバーハングアダプターを有するプライマー27Fmod（5′-AGRGTTTGATYMTGGCTCAG-3′）およびオーバーハングアダプターを有するプライマー338R（5′-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3′）からなるユニバーサル細菌プライマーセットを用いて、DNA（反応あたり約10 ng）から増幅した (79)。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）はTks Gflex DNAポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社、滋賀県草津市）を用いて実施し、以下のプログラムで増幅を行った：1サイクル98℃で1分間の変性；20サイクルの増幅（98℃で10秒、 55℃で15秒、68℃で30秒、最終伸長68℃で3分。増幅産物はAgencourt AMPure XPキット（Beckman Coulter, Atlanta, GA）で精製した。精製産物を以下のプライマーペアでさらに増幅した： p5配列を含むフォワードプライマー（5′-AATGATACGGCGACCA CCGAGATCTACAC-NNNNNNNN-TATGGTAATTGTAGRGTTTGATYMTGGCTCAG-3）。p5配列は各サンプル固有の8塩基対（bp）バーコード配列（Nの連続列で示される）であり、オーバーハンギングアダプターを含む。また、P7配列を含むリバースプライマー （5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-NNNNNNNN-AGTCAGTCAGCCTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3）はP7配列、各サンプル固有の8塩基対バーコード配列 （Nの連続列で示される）、およびオーバーハンギングアダプターを含む。Agencourt AMPure XPキットを用いた精製後、精製産物をほぼ等モル濃度で混合し4 nMライブラリプールを生成、その後最終ライブラリプールを6 pMに希釈（シーケンス用に10% Phix Control v3 （Illumina, San Diego, California）を添加した。最後に、メーカーの指示に従いMiSeqシーケンシングを実施した。本研究では2×300bpペアエンドシーケンシングを用いた。マイクロバイオーム解析データは、アクセッション番号PRJDB20714でDNA Data Bank of Japan（DDBJ）に登録済みである。
QIIME 2を用いた16S rRNA遺伝子配列解析
16S rRNA遺伝子配列解析は、一部修正を加えて記載された方法（80）に従って実施した。要約すると、フィルター通過リードはQuantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) 2 (2019.10.0) (81) に記載された方法に従い実施した。配列のノイズ除去およびトリミングには DADA2 を用いた。プライマー配列を除去するため、順方向リードの 5′ 末端から 20 bp、逆方向リードの 5′ 末端から 19 bp をそれぞれトリミングした。得られた135bpおよび220bpのリード（それぞれ5′末端由来）を後続の解析に用いた。分類群の同定にはSILVA132データベースとナイーブベイジアン分類器アルゴリズムを用いた（82, 83）。腸内微生物叢のアルファ多様性は、観察種数、Chao 1指数、Shannon指数を用いて解析した。UniFrac距離に基づくPCoAおよびANOSIMはQIIME 2を用いて実施した。
ショットガンメタゲノム解析
DNA抽出とシーケンス
DNA抽出およびシーケンスはMacrogen Japan Corp.（東京、日本）により実施された。簡略化すると、ライブラリ構築のため、サンプルからDNA/RNAを抽出した。品質管理（QC）実施後、適格サンプルはライブラリ構築へ進んだ。
ライブラリーキットとしてTruSeq DNA PCR-Freeキット（Illumina Inc. サンディエゴ、CA）を使用した。シーケンスにはIlluminaプラットフォーム（Illumina Inc. サンディエゴ、CA）を採用した。
シーケンス解析
生データは先行研究（84）と同様に前処理したが、若干の修正を加えた。本研究ではアダプタートリミングにcutadaptの代わりにfastp v0.20.0 (85)（デフォルトパラメータ）を用いて実施した。その他の手順は従来通り実施した。分類学的プロファイリングは、高品質リードをVITCOMIC2 (86)にマッピングして16S rRNAリードを抽出し、これをSILVA LTP v123 (87)データベースにマッピングすることで実施した。リードマッピングはBLAST (88)を用いて実施した。マイクロバイオーム解析データは、シークエンスリードアーカイブ（SRA）にアクセス番号PRJNA1221235で登録済みである
機能解析
高品質リードはIDBA-UDを用いてサンプルごとにアセンブルした。得られたスキャフォールドのオープンリーディングフレームはMetaGeneMark (89)を用いて予測した。50アミノ酸以上の遺伝子を選択し、DIAMOND (91)を用いてKEGG GENESデータベース (90)にマッピングした。bowtie2 (92)を用いて高品質リードをスキャフォールドにマッピングし、遺伝子長を補正することで遺伝子発現量を推定した。
腎保護作用に関する分析横断的キー項目の抽出
ルビプロストン投与に対する用量依存的応答を評価するため、代謝物解析、微生物叢解析、機能解析の全分析において以下の基準を満たす物質を抽出した：
1) ルビプロストン16μg群：P < 0.05（ショットガン）、P < 0.1（代謝物解析および16S）。
2) ルビプロストン8μg群：P < 0.3かつ16μg群と同様の正/負の変化方向。
3) プラセボ群：P ≥ 0.3または16μg群と異なる正/負の変化方向。
さらに、特に腎機能改善を示したルビプロストン治療反応者における顕著な変化を捉えるため、 16μgルビプロストン群を、腎機能がベースラインから改善した群（レスポンダー：eGFR変化量≥0）と改善しなかった群（ノンレスポンダー：eGFR変化量＜0）に分け、以下の基準を満たす物質を抽出した：
1) プラセボ群において治療前後で有意差がない（P ≥ 0.05）。
2) ルビプロストン16μgレスポンダー群において治療前後で有意差が認められる（P < 0.05）。
3) ルビプロストン16μgノンレスポンダー群において治療前後で有意差が認められない（P ≥ 0.05）。
レスポンダー
ノンレスポンダーとレスポンダーを評価するため、以下の基準を用いてデータを抽出した：
1) プラセボ群、レスポンダー群、ノンレスポンダー群それぞれについて、治療前（0週）と治療後（24週）の物質レベル変化量に対し、ウィルコクソン符号順位検定を用いてP値を算出；
2) レスポンダー群：P < 0.05（有意な変化を示す）；
3) 非反応群：P ≥ 0.05（有意な変化なし）；
4) プラセボ群：P ≥ 0.05（有意な変化なし）。
反応群と非反応群のベースライン差をさらに評価するため、両群間のベースライン代謝物解析およびメタゲノム解析結果を比較した。各解析から得られた代謝物、微生物分類群、およびKOは、P値の昇順でリスト化された。
ポリアミン濃度の測定
糞便中ポリアミン濃度は、従来法（93）に従い、誘導体化試薬として6-アミノキノリル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートを用いて測定した。分析には蛍光検出器付きACQUITY超高速液体クロマトグラフィーシステム（Waters社、米国マサチューセッツ州ミルフォード）を用いた。血漿ポリアミンはクロロホルム酸エチルと無水トリフルオロ酢酸で誘導体化後、GC-MSにより定量した（38）。分析にはGC-MS QP2010（島津製作所、日本・京都府）を用いた。
動物実験
本研究は実験動物の取扱い及び使用に関する指針に従って実施した。動物実験計画は東北大学動物実験委員会（2020-001-18）の承認を得た。C57BL/6マウスはCLEA Japan（東京都）より購入した。ルビプロストンとSPDは、それぞれViatris（米国ペンシルベニア州キャノンズバーグ）および和光（日本、大阪府）より購入した。腎性尿毒症モデル（RFモデル）では、6週齢C57BL/6jマウスに、無菌CE-2飼料に0.5%アデニン（和光、日本、大阪府）を添加した飼料を1週間与えて尿細管障害を誘導した (18, 94)。各群をさらに分け、アデニン食開始3日前からSPD（3 mM）を溶解した水を自由飲水により経口投与した。試験終了時、マウスをイソフルラン麻酔下で屠殺し、血液、尿、新鮮糞便、腎臓を採取した。ルビプロストン投与を伴うRF実験では、6週齢C57BL/6jマウスを0.2%アデニン含有滅菌CE-2食で6週間飼育した。その後、アデニン非含有CE-2食を2週間与え、ルビプロストン（500 μg/kg）を毎日経口投与した（18）。試験終了時、マウスをイソフルラン麻酔下で屠殺し、血液、尿、新鮮糞便、腎臓を採取した。全ての動物実験は東北大学医学部動物実験委員会により承認された。
組織学的検査
腎臓は10%中性緩衝ホルマリンで固定後、パラフィン包埋した。腎組織切片はヘマトキシリン・エオジン染色、マッソン三色染色（MT）で染色した。保存尿細管面積は、ImageJソフトウェア（NIH, Bethesda, MD）を用いて、20倍倍率でMT染色切片の腎皮質全体面積を測定し定量化した。
スピニングディスク共焦点技術
SoRaイメージングおよびミトコンドリア体積測定は、既報の方法（44）に従って実施した。腎組織は、Nikon Ti2顕微鏡と横河電機CSU-W1 SoRaシステムを組み合わせ、Apo全反射蛍光×100油DICN2対物レンズを用いて、zステップ0.12μmでzスタックとして撮影された。画像取得を自動化するため、NIS Elements多次元画像取得システムを用いて複数の尿細管をランダムに選択し撮影を行った。サンプルあたり合計5～9個の尿細管を撮影。SoRaイメージングおよび画像処理は大阪大学ニコンイメージングセンターにて実施。
ミトコンドリア体積、表面積、形態
ミトコンドリアネットワークは、Imarisソフトウェア（Bitplane, Concord, MA）を用いてネットワーク体積を解析することで定量化された。細管断面のSoRA画像はzスタックとして取得され、Imarisで3D再構築された。得られた画像は表面レンダリングに変換された。Imarisは個々のミトコンドリアと相互接続ネットワークを表面として識別する。画像解析を自動化するため、各データセットの解析開始時に表面レンダリングのパラメータを設定し、残りのサンプルはバッチ処理でレンダリングした。表面がレンダリングされると、体積、面積、強度などの定量化パラメータを生成できる。ミトコンドリアは以下基準で解析した：最大ミトコンドリアサイズ（立方マイクロメートル、特定視野内の最大ミトコンドリアネットワーク）、 近位尿細管細胞（PTC）あたりの総体積（立方マイクロメートル、視野内のミトコンドリア総体積／PTC核数）、およびPTCあたりのミトコンドリア数（n、ミトコンドリア数／PTC核数）。損傷後の断片化ミトコンドリアの割合を調査するため、PTCのミトコンドリアは球形度に基づき以下の3群に分類した：断片化型（球形度＞0.451）、中間型（球形度0.450～0.311）、糸状型（球形度＜0.310）。各群の割合（%）は、各群のミトコンドリア体積を総ミトコンドリア体積で除して定義した。各サンプルにつき5～9本の尿細管を分析し平均値を算出した。
ミトコンドリア機能測定
ヒト近位尿細管細胞株HK-2を、10%胎児牛血清 （FBS）を添加したDulbecco『s modified Eagle』s medium（DMEM）で培養し、FBS不含DMEM 0.1 mlを添加した96ウェルプレートに1ウェルあたり1.0 × 104細胞の密度で播種した。指定された最終濃度のSPDを添加後、HK-2細胞を48時間培養した。具体的な曝露濃度と時間は、既報（95）に基づいて決定した。HK-2細胞の生体エネルギー解析は既報の方法に従って実施した（21, 45, 96）。簡潔に述べると、酸素消費率（OCR）はSeahorse XF e96アナライザー（Agilent, CA）を用いて測定した。アッセイ前、細胞をアッセイ培地（10 mMグルコース、1 mMピルビン酸、2 mM L-グルタミン添加DMEM）中でCO2なしで60分間インキュベートし、平衡化を促した。その後、基礎条件下でOCR測定を実施し、続いて酸化リン酸化経路を標的とした2μMオリゴマイシン、1.5μMカルボニルシアン化p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン、0.5μMロテノン/アンチマイシンAを順次注入した。
RNAシーケンス
RNAシーケンスライブラリ調製は、製造元の指示に従いQIAseq Stranded RNA Library Kits（カタログ番号180451、QIAGEN）を用いて実施した。イルミナライブラリは環状一本鎖DNAライブラリに変換した。RNAシーケンスはDNAFORM（神奈川県横浜市）により実施された。Fastq形式のシーケンスリードはFastQCを用いて品質評価した。生リードはまずTrimmomatic-0.39を用いて低品質リードを除去するフィルタリング処理を施した。得られたリードはSTAR（バージョン2.7.10a）を用いてマウスGRCm39ゲノムにマッピングした。アノテーション付き遺伝子上のリード数はStringTie（v2.2.0）を用いてカウントした。遺伝子発現レベルはBioconductorパッケージedgeR（バージョン3.15）で測定した。RNA-seqデータはSRAにアクセス番号PRJNA1256056で登録済みである。
マルチオミクス解析および動物実験の統計解析
レスポンダー群とノンレスポンダー群は以下の基準で分類した：
1) レスポンダー群 - ベースラインからのeGFR変化量 ≧ 0 ml/min/1.73 m² (n = 9)
2) 非反応群 - ベースラインからのeGFR変化量 <0 ml/min/1.73 m2 (n = 10)
これらに加えプラセボ群(n = 13)を設け、3群で解析した(図S8)。代謝物プロファイル、16S rRNA、およびショットガンメタゲノム解析では、各群においてルビプロストン投与前後の比較にウィルコクソン検定を実施した。レスポンダー群で有意に変化したが他の2群では変化しなかった細菌および代謝物を同定した。16S rRNA解析では、各群の効果サイズを評価するためALDEx2（37）を用いた追加解析を実施した。基準は、レスポンダー群では効果サイズが−0.3未満または0.3超、プラセボ群では効果サイズが−0.3超または0.3未満とした。ポリアミンについては、 各群におけるルビプロストン投与前後の比較にはウィルコクソン検定を、群間比較にはマン・ホイットニーのU検定を用いた。ベースラインからの変化量の群間比較には、臨床試験評価法に基づきANCOVAを用いた。マウスモデル解析には一元配置分散分析（ANOVA）とTukey検定、またはマン・ホイットニーU検定とHolm法を用いた。ミトコンドリア形態の定量解析では、群間有意性検定にノンパラメトリックなKruskal-Wallis検定と事後多重比較検定（多重検定補正としてDunn法）を実施した。マルチオミクス解析は探索的解析として実施したため、多重検定補正は考慮しなかった。したがって、結果は仮説検定として解釈すべきではなく、探索的指標として用いるべきである。マルチオミクス解析における統計解析は、R v4.2.1（https://r-project.org/）およびGraph Pad Prism v10.0.3（GraphPad Software）を用いて行った。
謝辞
技術的・組織学的支援をいただいた東北大学大学院医学系研究科の加藤真也、中正明、東北大学医学部組織学プラットフォームの伊達芳樹、吉澤真、柴田直樹、田澤智、ならびに協同乳業株式会社の生田健、田中和也に感謝する。
資金提供：本研究は下記の助成を受けた：医療研究開発機構（AMED）トランスレーショナルリサーチネットワークプログラム（C35）（JP24zf0127001）（T.A.宛）；AMED新薬開発研究（JP22ek0210133）（T.A.宛）； 文部科学省科学研究費補助金（JP18H02822）（T.A.宛）；日本学術振興会科学研究費補助金（JP21H02932）（T.A.宛）。本試験用のルビプロストンは、サンプファーマ株式会社（神戸市）より提供を受けた。
著者の貢献： 構想立案：E.M.、T.To.、T.A. データキュレーション：S.W. 形式的分析：S.W.、T.Ya.、S.M.、H.T.、Y.Ton.、T.Ka. 調査：S.W.、S.F.、T.So.、M.M.、K.T.、H.K.、K.K.、 C.S.、M.U.、R.K.、T.Ka.、およびLUBI-CKD試験研究者グループ。方法論：S.F.、T.So.、T.Ya.、S.M.、M.M.、Y.N.、K.T.、K.F.、Y.M.、Y.A.、Y.Tom.、S.I.、C.K.、Y.O.、およびT.Sa. プロジェクト管理：T.To.、T.A.リソース：M.N.、T.Y.、S.S.、Y.U.、A.K.、K.A.、Y.S.、T.Ko.、J.J.K.、T.Su.、およびLUBI-CKD試験研究者。監督：T.Ta. 可視化：S.W.、H.T.、K.T.、Y.Ton.、T.Ka.原稿作成：S.W.、 T.To.、T.A. 執筆—査読および編集：S.W.、T.To.、T.A. 資金調達：T.A. 全著者は最終稿を読み、承認した。
利益相反： T.A.は日本でCKDに対するルビプロソートの特許（JP6090723B2）を保有している。著者はその他の利益相反がないことを宣言する。
データおよび材料の利用可能性： 本論文の結論を評価するために必要な全データは、論文本文および／または補足資料に含まれている。ただし、プライバシー保護のための機関審査委員会による制限のため、個々の参加者レベルのデータおよび生物学的サンプルは共有できない。追加解析（16S rRNAアンプリコン、ショットガンメタゲノミクス、RNA-seqを含む）のシーケンスデータは、DDBJトレース/リードアーカイブ（DRA）およびNCBIシーケンスリードアーカイブ（SRA）といった公開リポジトリに登録済みである。対応するBioProjectアクセス番号とリンクは以下の通りです：PRJDB20714 (DRA)：https://ddbj.nig.ac.jp/search/entry/bioproject/PRJDB20714、PRJNA1221235 (SRA): https://ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA1221235, および PRJNA1256056 (SRA): https://ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA1256056。生データは、これらのBioProjectリンクから関連するSRA/DRAエントリーにアクセスすることで入手可能です。本研究で生成および/または解析されたデータセット（メタボロミクスデータ、腸内微生物叢の分類学的プロファイル、KEGGオルソロジープロファイルを含む）は、補足生データセットで入手可能です。臨床データおよび生物学的サンプルについては、倫理的に承認された研究へのアクセスについて問い合わせを希望する研究者は、対応著者（T.A.：Email: takaaki.abe.d1@tohoku.ac.jp; 所属： 東北大学医学部）またはデータアクセスコordinator（非著者）（S. Goto：Email: sawako.goto.d8@tohoku.ac.jp；所属：東北大学大学院医学系研究科 臨床生化学・内分泌学講座）までお問い合わせください。
補足資料
PDFファイルには以下が含まれます：
図S1～S14
表S1～S19
LUBI-CKD試験研究者グループ
データS1の説明図
9.10 MB
本論文のその他の補足資料は以下の通りです：
データS1
37.14 MB
参考文献および注記
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