仿生纳米结构用于眼压传感

受长尾玻璃翼蝴蝶启发的用于医疗设备的多功能生物光子纳米结构

维纳亚克·纳拉西曼1,4,拉德瓦努尔·哈桑·西迪克1,4,李正恩1,2,沙伊拉布·库马尔1,布莱斯·恩贾门1,杜鹃3,娜塔莉·洪1,大卫·斯瑞塔万3*和许赫柱1,2*

许多生物体拥有提供色彩和其他多种生存功能的生物光子纳米结构。尽管这类结构已被广泛研究并在实验室中成功复制，但其在生物医学应用中的潜力仍不明确。本文展示了一种受长尾玻璃翼蝶（Chorinea faunus）启发而设计的透明光子纳米结构，并展示了其在体内眼内压（IOP）传感器中的应用。我们利用两种不相容聚合物（聚甲基丙烯酸甲酯和聚苯乙烯）之间的相分离，在Si3N4基底上形成纳米结构特征。所制备的光子膜表现出良好的角度无关的白光透射性、强亲水性和抗生物污染性能，可有效防止蛋白质、细菌和真核细胞的粘附。随后，我们开发了一种微型可植入眼内压传感器，将该光子膜作为光电机械传感元件使用。最后，我们在新西兰白兔上进行了体内测试，结果表明，与传统回弹式眼压测量法相比，我们的设备在无炎症迹象的情况下显著降低了眼内压测量均值的变异。

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C.faunus的多功能纳米结构

C. f aunus（图1a）属于分布于南美洲的里迪尼达科家族。C. f aunus的翅膀与其他自然界中透明翅膀有明显区别9,11,22。其具有两种透光特性不同的透明区域，这种组合十分罕见：靠近胸部的基部透明区域（图1a中蓝色箭头所示）；以及远离胸部的后中域透明区域（红色箭头所示）

如图1a所示，前翅和后翅均具有亚缘带透明区。对亚缘带透明区进行高分辨率扫描电子显微镜（SEM）观察，发现其具有中等长径比（1.090 ± 0.041）的圆顶状纳米柱（图1b,c和补充图1），与其他具有较高长径比的天然透明翅膀相比有所不同（> 1）10–12。有趣的是，基部透明区由形状相似但密度较低的纳米结构组成（图1d）。扫描电镜图像的二维快速傅里叶变换显示为环形分布（图1c,d插图），证实了这些纳米结构呈短程有序排列11,23。k空间中环的有限直径表明，亚缘带区域和基部区域的纳米结构平均周期分别为140–180nm和200–300nm。

C.f aunus翅膀上不同区域的平均结构周期变异对翅膀上的光散射程度起着重要作用。平均周期低于200nm的亚缘带区域在可见光–近红外（VIS–NIR）范围内保持无散射且具有抗反射特性，这一点可通过有效介质理论和传输矩阵模型得到很好的解释，正如自然界中其他抗反射亚波长纳米结构所表现出的特性一样11,24 （补充图2）。平均周期超过200nm、与光波长相当的基底面积区域，由于分布较稀疏、中等高宽比的低折射率纳米结构，表现出前向窄角散射效应25,26。我们在波长为420nm条件下对这两类纳米结构进行了时域有限差分模拟，所得结果一致，证实了基底面积区域的散射机制（图1e,f）。

尽管在模拟中我们对两组结构使用了相同的高度和直径，但周期为150nm（类似于亚缘带区域）的纳米结构并未改变透射场（图1e），而周期为300nm（与基底面积相近）的纳米结构则表现出透射光的前向散射（图1f）。基部区域的散射现象还通过图1g,h中可见‐近红外范围内的镜面透射率与总透射率之间的差异得到证实。

为了进一步分析这两个区域的透射散射特性，我们在可见光范围内进行了角度分辨散射光谱测量，并改变了入射角和探测角度（图1i,j）。在可见‐近红外范围内具有几乎相同的镜面透射率和漫透射率（图1g），亚缘带区域表现出低散射角的镜面透射率，散射角为±3 °（图1i）。相比之下，基底面积以向前方向散射光线，散射角高达 ± 12°，并且随着入射角的变化几乎没有变化，显示出其潜在的非常有用的角无关散射特性（图1j）。这种散射特性可以缓解在大角度下检测光学信号的困难，这是许多基于光的设备中常见的挑战14例如可植入式眼内压传感器15。（有关C. f aunus翅膀上多功能透明性及其双重纳米结构基础的生物学意义的更多细节，请参见补充章节1以及补充图3和4。）

此外，C.f aunus翅膀上纳米结构的周期也会影响其润湿性，亚缘带和基底面积测得的静态接触角分别为105°和85°。由于表面粗糙度27较高，亚缘带区域的接触角更大。在我们的实验中，这些具有适中长径比的纳米结构与具有高长径比的纳米结构类似，能够抵抗微生物和细胞生长（补充图5和6）。

仿生纳米结构膜的显影

受C. f aunus翅膀基部区域纳米结构的启发，我们利用基于聚合物相分离的高度可扩展的自下而上fabrication工艺，在Si3N4‐膜（图2a）上实现了短程有序纳米结构28,29。选择Si3N4是因为其在硅基底上易于制备，并且已被证实可作为微器件中光学透明且机械强度高的自支撑膜，同时具有优异的性能；此外，其固有的亲水性对于纳米结构的防污性能至关重要，这一点将在本文后续部分详细讨论。

我们创建了宽高比在0.15至0.90范围内的盘状纳米结构，并进行了参数化研究以确定其光学特性和抗生物污染性能（补充图7）。具有0.45宽高比的纳米结构（图2b），小于在C. f aunus翅膀上发现的纳米结构的长径比（≈ 1），被证明能在抗生物污染性能和角度无关的光学特性之间实现最佳平衡，最适合用于光学植入物（补充章节2）。因此，除非另有说明，集成在膜上的纳米结构的宽高比均为0.45。

纳米结构硅膜的扫描电镜图像3N4‐膜如图2c所示。插图中扫描电镜图像的二维快速傅里叶变换表明具有短程有序，平均周期为445 ± 60 nm，与基底面积的周期性相似。接触纳米结构硅3氮4膜表面的接触角为17°，相较于平面硅3氮4无纳米结构时测得的38°，表明其亲水性增强（补充图8）。

我们利用角度分辨透射光谱在可见‐近红外范围内表征了纳米结构硅3氮化物4膜的光学特性，并将其与无纳米结构的平面硅3氮化物4膜进行了比较（图2d,e）。利用这些纳米结构，硅3氮化物4膜透射的50%角度无关性得到改善。对所制备结构的三维模拟（补充图9b）进一步证实了改进的角度无关透射率。这种角度无关传输源于短程有序纳米结构引起的前向散射的各向同性，该特性与入射角无关（图1j）。由于总透射率是通过薄膜的弹道（镜面）透射和由纳米结构引起的散射透射的组合（补充图10）32,散射组分的角度无关特性降低了总透射率的整体角度依赖性。

纳米结构表面的生物物理性质

体外测试比较了代表性蛋白质、原核生物和真核生物在纳米结构和平面 Si3N4表面的粘附性，以赖氨酸涂层玻璃片作为阳性对照。平面Si3N4是中等亲水性（接触角：35–40°），已知由于蛋白质吸附增加，相较于更亲水的表面（接触角：< 20°)33,34，能显著促进细胞黏附和增殖。因此，我们通过将纳米结构的长径比从0.15调节至0.90，进一步提高了Si3N4表面的亲水性，并系统地调控了表面亲水性（补充图8）。当实现强亲水性后（接触角：<20°），表面会形成由纳米结构介导的水性屏障，限制蛋白质吸附和细胞黏附，从而提供抗粘附性能（补充章节3，补充图11和16）6,35,36。

我们最初研究了两种代表性蛋白质的表面粘附情况：荧光标记的牛血清白蛋白，因其在血液‐材料相互作用中的关键作用4以及对生物材料表面具有较高的非特异性结合亲和力37；以及链霉亲和素，因其对硅3氮4表面具有特异性结合亲和力38。基于荧光强度的黏附力定量分析（图3a 和 b 以及补充图11）表明，对于白蛋白和链霉亲和素，平面硅3氮4表面的粘附分别比纳米结构硅3氮4表面高出三倍和两倍。

然后我们使用表达绿色荧光蛋白的Escherichiacoli来定量细菌黏附（补充图12）。除了作为一种常用的原核模型外，E.coli还因其具有引起革兰氏阴性且常为抗生素耐药性感染的潜力而被选中，这些感染常发生在植入物表面及周围39,40。通过菌落形成单位（CFU）的测量（图3c）和荧光强度测量（补充图13），对每种表面上的细菌进行了定量。两个结果均表明，与平面Si3N4相比，纳米结构表面的细菌黏附显著减少。此外，纳米结构表面上单个细菌细胞的扫描电镜图像显示其形态未受破坏，表明无物理裂解发生（补充图14）。

HeLa细胞系因其已证实的强健性、快速生长速率和贴壁特性而被选为真核生物的代表，这使其在粘附和细胞毒性检测中得到频繁使用41,42。72h后，平面Si3N4上的贴壁细胞密度是纳米结构Si3N4表面的八倍（图13d和e）。接下来，在72h 期间每24h计算一次各表面上的死亡率，即死细胞数与活细胞数之比。两种表面在72h后的死亡率差异无统计学显著性（补充图15），这表明纳米结构表面抑制了真核生物的粘附和增殖，但未引起细胞死亡。

这些结果凸显了基于强亲水性和抗粘附特性的抗生物污染方法的优势（补充图11–16）。无论表面化学组成如何43，具有锥形尖端或圆顶形尖端的高或中等长径比纳米结构（如C.faunus中所示）均表现出显著的几何依赖性杀菌特性，可在细胞壁上诱导产生较大的应力和形变，并主动当与哺乳动物细胞接触时，促进自溶44。依赖物理裂解的抗生物污染方法可能会不希望地损伤植入物周围的组织并引发炎症。补充表1显示，如果纳米结构的宽高比为1或更大，则在天然或合成的纳米结构表面上均会发生物理裂解。因此，通过将纳米结构的宽高比保持在0.45，利用其抗粘附性能以防止生物污染，而不会引起任何物理裂解。此外，纳米结构表面的亲水性源自表面拓扑，这可能在长期可靠性方面优于化学处理方法。（参见补充章节3和补充图17。）

纳米结构在眼内压传感中的应用

To demonstrateame dical application f或μ ltif unctiona l 纳米结构，我们使用纳米结构的硅3N4‐膜作为微型可植入眼内压传感器中的光机传感元件，该传感器是一种密封的、压力敏感的法布里‐珀罗谐振器15。平面或纳米结构的柔性硅3N4‐膜构成法布里‐珀罗谐振器的顶面，镜面状的刚性硅构成底面。该传感器在近红外波段进行了优化，以最小化组织和水中的吸收。当环境压力或眼内压发生变化时，薄膜将相应发生偏转，由此引起的共振波长变化将通过反射方式远程捕获（图4a，补充图19）。体内测试表明，基于法布里‐珀罗的IOP传感器存在读取角度狭窄的问题，严重限制了其作为传感器的实用性，并且还存在生物污染问题，会缩短传感器寿命15。

为了研究读出角度的依赖性，我们比较了在1atm下纳米结构传感器和平面传感器的眼内压传感器测量结果（图4b–d）。平面传感器在入射角为12°时产生了最大16nm的共振偏移（图4b）。相比之下，纳米结构传感器在12°时产生2nm，在30°时产生5nm的偏移。反射共振强度的衰减也作为入射角的函数进行了测量（图4c）。对于平面传感器，当入射角达到12°时，强度衰减至零，而纳米结构传感器的信号直到30°仍可检测。平面传感器的眼内压测量误差在12°时达到4.59mmHg（图4d），约为人类生理眼内压范围（10–20mmHg）的46%，超过了现有临床眼压计的± 1.2mmHg误差范围（http://www.icaretonometer.com/, http://www.reichert.com/）。另一方面，纳米结构传感器在12°和28°时的眼内压测量误差分别为0.07和 0.92mmHg。这些结果突显了纳米结构传感器的宽角度性能。

在与数字压力计连接的压力控制室中测试时，纳米结构传感器在感兴趣的临床范围0至32mmHg内表现出优异的线性度（相关系数：~1.00）（图4e）。最大读取误差为0.26mmHg，大约是平面传感器（1mmHg）的四分之一。

将纳米结构传感器和平面传感器分别植入两只新西兰白兔的前房，以研究其体内光学性能和生物相容性（图5a）。为了评估传感器测量的稳定性，计算了每组光谱中最显著峰相对于该组均值的偏移量（图∆λ 5b）。纳米结构传感器的光谱标准差为0.6nm，而平面传感器为1.3nm（图5c）。此外，使用纳米结构传感器测得的眼内压测量标准差为0.23mmHg，而同时使用平面传感器和测压法测得的标准差分别为0.64mmHg和1.97mmHg（图5d）。纳米结构集成所增强的角度无关性提高了光学测量在面对呼吸运动、细微的眼球运动等潜在误差源时的稳定性和准确性探测器错位。此外，间接眼压测量技术（如测压法）会受到角膜厚度、曲率和生物力学等多种因素的影响，通常比直接眼压测量技术（如可植入传感器）更容易产生误差15,45。

两种传感器在植入一个月后被取出，以定量分析表面的细胞生长情况并评估其生物相容性。我们使用共聚焦荧光显微镜在取出时确定组织生长程度和细胞活力。DAPI染色剂用于定位所有组成细胞，而可选择性结合肌动蛋白的鬼笔环肽则用作细胞过程和健康状况的指标46。此外，基质金属蛋白酶‐2（MMP‐2）因其在各种炎症和修复过程中的作用，被用作炎症的指标47。

图5e,f分别显示了平面传感器和纳米结构表面传感器的z 轴堆叠多通道免疫荧光图像的顶视图。约59%的平面传感器表面被组织覆盖，且存在大量丝状F‐肌动蛋白网络（图5e，绿色），表明在取出时已有健康组织生长。此外，在平面传感器的膜上观察到MMP‐2（图5e，红色），这可能引发了细胞向该区域的大范围迁移。相比之下，纳米结构表面约有5%的区域被组织覆盖，提升了12倍与平面传感器相比，纳米结构传感器上未检测到MMP‐2信号，表明在平面传感器上存在的细胞信号传导和迁移模式在纳米结构传感器上不存在。这说明植入后未发生炎症，突显了纳米结构在显著改善医用植入物体内生物相容性方面的潜力。

结论

受透明长尾玻璃翼蝴蝶（C.f aunus）翅膀上短程有序纳米结构的启发，我们设计了适用于医疗植入物的生物光子纳米结构。通过调节纳米结构的关键物理尺寸，我们实现了结构诱导散射，扩大了光学读出角度，并改善了防污性能，同时抑制炎症，适用于眼压传感植入物。在青光眼治疗中，准确的眼内压监测是疾病诊断与管理的唯一主要手段45,，而用于眼内压监测的光学传感方法在微型化、能效和监测频率方面已展现出广阔前景15；然而，其在读出角度和生物相容性方面仍需改进以实现实际应用。将这些纳米结构集成到眼压传感植入物上，显著扩展了其检测范围，并使平均体内眼压误差降低了三倍。此外，这些纳米结构有效抑制了生物污染和炎症达12倍，从而实现了一种高度实用的长期眼内压监测植入物。我们这项仿生工作的进一步发展，包括利用移动设备进行连续眼内压监测，并集成基于记忆的追踪等功能48,将有助于改善青光眼的治疗效果，降低视力障碍和失明的风险。凭借这些令人鼓舞的结果，我们预计众多医疗技术和设备将极大地受益于生物光子纳米结构的多功能性。