粪肠球菌Fsr系统调控肽设计

粪肠球菌Fsr群体感应系统的高效激活剂和抑制剂的合理设计

多米尼克·N·麦克布莱尔，克里斯西·D·卡梅隆，布鲁克·K·甘特曼，伊夫塔赫·塔尔‐甘*
内华达大学里诺分校化学系，美国内华达州里诺市北弗吉尼亚街1664号，89557，美国。

摘要

细菌对抗生素耐药性的日益增长迫切需要寻找替代治疗方法，以降低细菌的适应能力。粪肠球菌仍是临床肠球菌感染的主要致病菌，并表现出依赖群体感应（QS）的致病性。本文报道了基于大环肽的粪肠球菌Fsr群体感应系统的高效激活剂和抑制剂的开发。为此，我们开发、优化并比较了三种含内酯的大环肽骨架的合成路线。随后，结合已有的和当前对天然QS信号肽的构效关系（SAR）研究，合理设计出迄今为止最高效的Fsr群体感应系统激活剂和抑制剂。这些肽的应用可能提供一种在不显著增加细菌耐药性选择压力的情况下减弱粪肠球菌致病性的方法。

引言

粪肠球菌是一种共生的革兰氏阳性细菌，也是一种机会性病原体，尽管屎肠球菌感染呈上升趋势，但粪肠球菌仍是临床肠球菌感染的主要病因。粪肠球菌通常存在于人体肠道中，但也可感染血液（菌血症）、泌尿道，并在心脏定植引发心内膜炎。粪肠球菌对多种抗生素具有固有耐药性，并能快速产生或获得新的抗生素耐药性。此外，研究显示粪肠球菌可与其他物种共享耐药基因，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）等多重耐药菌株。临床粪肠球菌感染带来的医疗负担，以及其发展和传播抗生素耐药性的能力，凸显了开发替代策略以根除粪肠球菌感染的迫切需求。

一种对抗细菌感染的传统抗生素替代策略是开发能够减弱细菌致病性而非诱导细胞死亡的分子。该方法减少了产生耐药性的选择压力，同时仍能消除细菌的许多有害影响。9-13粪肠球菌是这一策略的理想靶标，因为它表现出对群体感应（QS）的依赖，以协调诸如生物膜形成和毒力因子产生等致病性群体行为。14-17

群体感应是细菌用来评估细胞密度并协调群体行为（包括生物膜形成、毒力因子产生、孢子形成、感受态诱导、群游和生物发光）的一种通讯方式。10, 14, 18‐22革兰氏阳性菌中的群体感应依赖于自诱导肽（AIPs），这些肽由细菌产生并分泌。细菌利用AIP来评估局部细胞密度，并负责激活群体感应通路。当AIP浓度达到足够高时，会激活一种膜结合受体（通常为组氨酸激酶受体），从而上调群体感应基因（使细胞同步进行群体行为）以及激活群体行为的相关基因。10, 14, 18 ‐21,23

在粪肠球菌中，致病性的主要调控因子称为Fsr群体感应系统（图1）。该系统利用一种由11个氨基酸组成的环状自诱导肽（AIP），即明胶酶生物合成激活信息素（GBAP）以激活Fsr依赖性基因。10, 14-16, 24该肽具有一段从肽N端延伸出的双氨基酸尾部。该尾部从一个丝氨酸残基延伸而出，该丝氨酸残基对于其侧链与C端甲硫氨酸残基的羧酸之间形成内酯大环连接至关重要。本课题组及其他团队开展的构效关系（SAR）研究已确定了关键的侧链及其手性取向，以及可耐受修饰的位点。3, 25, 26 此外，已有研究评估了阻断Fsr群体感应系统的治疗潜力，并开发出一种基于GBAP的强效竞争性抑制剂，能够减弱粪肠球菌的群体感应依赖性致病性。27, 28

在本研究中，我们报道了基于GBAP的Fsr群体感应系统的激动剂和拮抗剂的合理设计。为此，我们利用先前报道的构效关系信息，提出机理假设，并在构建非生物GBAP类似物过程中加以实施。该项工作扩展了对GBAP分子的构效关系知识，并成功开发出迄今为止活性最强的激动剂和拮抗剂，其活性处于低至亚纳摩尔范围。

结果与讨论

疏水环区域（立体）构效关系研究

为进一步阐明GBAP（1）环区的构效关系（SAR），特别是Phe7、Gly8和Trp10在受体结合与激活中的作用，我们通过引入保守点突变来评估这些位点。首先，我们发现将Gly8替换为丙氨酸（GBAP‐G8A，2）会导致完全丧失活性。由于该修饰实质上仅引入了一个手性中心，我们推测Gly8的作用是使肽链在此位置能够采取更类似于D‐氨基酸的构象。因此，用D‐丙氨酸取代Gly8应具有更高的耐受性，并产生能够有效结合并激活FsrC受体的类似物。事实上，将Gly8替换为D‐丙氨酸（GBAP‐G8a，3）相较于天然GBAP仅导致效价适度降低（效价下降20倍，而引入L‐丙氨酸时则完全丧失活性；表1）。

之前，我们发现将Phe7位置的构型反转（GBAP‐f7,4）出乎意料地被很好地耐受（效价仅降低5倍）。这一结果进一步支持了我们的假设，即该区域需要类似D‐氨基酸的取向（通过天然GBAP中甘氨酸提供的灵活性实现），以使GBAP呈现生物活性构象。此外，尽管这一结果可能已经在一定程度上可归因于相邻甘氨酸的灵活性，但也可能是由于受体结合口袋的空间混杂性，使得该位置的不同侧链及其取向均能有效结合。为了验证第二种可能性，制备了将Phe7替换为色氨酸和D‐色氨酸的类似物。结果发现，色氨酸取代物（F7W，5和F7w，6）的效价略高于相应的苯丙氨酸类似物（表1）。然而，将天然的Trp10和Phe7残基同时交换得到化合物7（GBAP‐F7WW10F），其效价降低了27倍。此外，将Trp10替换为Phe（GBAP‐W10F，8）所得类似物的效价降低了5倍。最后，将两个残基均替换为丙氨酸（GBAP‐F7AW10A，9）导致活性完全丧失，该结果与先前报道一致。综合来看，这些结果强调了第10位较大体积的色氨酸侧链的重要性，而Phe7残基则具有可修饰性，可能通过优化以增强肽‐受体结合。此外，化合物7相较于两个单取代类似物（5和8）效价显著降低，表明该残基交换引起了相对于天然GBAP或单取代类似物的显著构象变化。最后，已证实第7位具有空间混杂性，说明Phe残基并未完全占据FsrC中的结合口袋。然而，该位置可接受修饰的范围尚未完全明确。

尾部和环化构效关系研究

我们先前报道过，乙酰基（图2A）作为足够的环外尾部足以维持GBAP的活性（10，表1）。相反，一个类似的缺乏尾部并使用内酰胺环进行头尾环化的类似物则完全失去活性（11），而Ser3位点的D‐氨基酸突变（GBAP‐s3，12）导致活性降低了40倍。综合来看，这些结果表明Ser3的手性反转引起了构象变化，导致环外尾部与FsrC结合位点发生冲突。因此，我们推测在此类似物中用乙酰基替换尾部将提高其活性。事实上，Ac‐GBAP‐Des(Q1N2)s3（13）相较于全长类似物（12）表现出6倍的效价提升。有趣的是，一种头尾内酰胺环化类似物（14，表1）的活性也高于其L‐丝氨酸3对应物（11），这表明即使Ser3的侧链未直接参与环化，其构型反转也会引起环构象的显著变化。

先前发现，GBAP容易发生尾部降解，从而在N端形成焦谷氨酸环（图2B）。3, 29, 30我们推测，GBAP固有的不稳定性可能具有调控作用，使细菌能够准确检测其种群密度的变化。为了验证这一假设，我们合成了焦谷氨酸降解产物的D型和L型，并对其进行了评估。结果发现，L型（15）的活性与天然GBAP相当，而D型（16）的效价则低约3倍。这些结果否定了焦谷氨酸降解是经由进化压力选择而来并在评估种群密度中发挥调控作用的观点。

基于GBAP的超激动剂的合理设计

在本研究中，我们的目标是开发具有增强效价的GBAP类似物，以用于调控Fsr群体感应系统。为此，我们首先希望优化GBAP与FsrC受体之间的结合相互作用。我们对GBAP信号进行的综合构效关系研究揭示了若干侧链和手性修饰，可使肽的效价提高约5倍。这些修饰包括Gln1和Asn2位点（分别为q1和n2）构型的翻转、Pro4被丙氨酸取代（P4A），以及在N端添加Z基团。我们推测，将这些修饰组合起来会产生加成效应，从而获得效价进一步提高的GBAP类似物。因此，我们合成了一系列双突变和三突变类似物文库，其中包含了q1、n2和P4A修饰的不同组合，并且部分带有或不带N端的乙酰基（表2）。结果表明，在N端添加乙酰基——尽管在我们之前的研究中显示为一种可耐受的修饰——当与上述任一修饰组合时，其活性均低于相应不含乙酰基的GBAP类似物。此外，我们发现某些修饰彼此之间存在不兼容性（例如q1与P4A），导致所得类似物的效价较GBAP降低。最重要的是，我们鉴定出两种双突变类似物（GBAP‐q1n2（19）和GBAP‐n2P4A（21）），其活性显著提高（效价分别比GBAP提高11倍和24倍；表2）。

为了进一步优化上述两种先导肽，我们将Z‐基团引入两个支架中，得到Z‐GBAP‐q1n2（30）和Z‐GBAP‐n2P4A（31）（表2）。有趣的是，将Z‐基团引入GBAP‐q1n2后，其效价适度提高了2倍；而将同样的修饰引入GBAP‐n2P4A后，其效价则下降了3.5倍（表2）。这些结果与上述q1和P4A修饰之间的不兼容性一致，表明P4A修饰无法耐受N端残基的手性反转或N‐末端封端。图3总结了理性设计的激动剂相对于GBAP在效价上的倍数变化（增加或减少）。

基于GBAP的拮抗剂的开发

除了开发更好的激动剂外，我们还致力于开发拮抗剂，以期为减轻粪肠球菌感染提供一种替代治疗方法。由于此前已有强效拮抗剂的报道（32），我们采用该结构作为支架，用于进一步开发高效抑制剂。

令人意外的是，我们发现先前报道的先导抑制剂（32）在我们的实验中基本无活性，即使在低浓度竞争物（天然GBAP，5nM）条件下，其IC50> 10也高达1000nM。该系列中所有其他尾部修饰的类似物也同样无活性（表3；有关此系列化合物活性显著偏低的讨论见下文，包括合成优化以及为验证该结果所采取的步骤）。

由于我们的合成方法产率更高，并且通过避免溶液中环化步骤实现了更快的合成，因此我们开发了一系列在序列中重新引入Gln9作为树脂连接点的拮抗剂类似物。单个回突变类似物（36）耐受性良好，在50nMGBAP存在下其IC50为227nM。为了更好地理解先前报道的抑制剂相关的构效关系27 ，我们还开展了研究，探讨了在原始支架上进行的相同尾部修饰的重要性（表3）。我们发现，在N端引入Z基团对抑制活性略有不利影响，因为去除该基团（类似物35）导致效价轻微提高，表现为IC50值相对于含Z基团的类似物（36）大约降低了1.5至2倍。同样地，用不同的封端基团（乙酰基，38）取代后，其效价相较于35降低了3倍。如前所述，具有游离N端的类似物可能降解形成焦谷氨酸残基3。因此，我们也测试了该降解产物（37），结果显示其作为拮抗剂的活性比35低约2倍。同样地，去除尾部并对肽进行封端（39）得到的类似物是该系列中活性最低的（与35相比效价损失约6倍）。综合来看，这些结果解释了为何基于已发表支架（32‐34）27所制备的所有肽类似物均被发现无活性。此处观察到的趋势表明，只有游离N端的类似物才会比母体肽支架（32）更具活性，而我们未能成功合成该类似物（见下文）。

在增强激动剂的研究过程中，我们发现了一些显著提高GBAP与FsrC受体结合亲和力的修饰。我们假设，在我们的树脂上相容性抑制剂（35和36）中引入相同的修饰，将提升这些抑制剂的效价。然而，结果表明事实并非如此。基于我们两种最有效激动剂所设计的四种拮抗剂类似物，其活性均低于各自的母体化合物（35或36；表3）。其中，包含q1n2修饰和Z基团的拮抗剂类似物（40）比36的效价低2倍；而包含n2和P4A修饰并带有Z基团的拮抗剂类似物（41）则完全丧失了抑制活性。同样地，包含q1n2修饰但不含Z基团的类似物（42）比35的效价低约7倍，而包含n2P4A修饰但不含Z基团的类似物（43）也与41类似，完全失去了抑制活性。尽管根据之前观察到的P4A与Z基团修饰之间的不相容性（表 2），41活性降低是可以预见的，但40相较于36的效价下降，以及与35相比，42和43的尾部修饰表明，尾部修饰与将GBAP转化为竞争性抑制剂所需的环状修饰不兼容。

产生拮抗剂所需的最小修饰

在我们发现将先前报道的抑制剂（32）重新引入Gln9得到36后，其效价提高了>50倍，我们着手确定将GBAP转化为抑制剂所需的最小修饰。从36开始，该类似物是与先前报道的抑制剂（32）最接近且适用于我们完全树脂上合成路线的化合物，我们首先将Met11回复突变为45。该类似物保留了其抑制特性，但效价比36低>4倍。由于从36中去除Z基团得到35后，在保持抑制行为的同时效价略有提高，因此我们推测从45中去除Z基团将获得更优的抑制剂。事实上，44的效价比45高出>2倍（表3）。有趣的是，该类似物与GBAP仅在一个残基上不同（Asn5至苄基酪氨酸（YBzl；图2D）），被发现是一种部分激动剂，因为它未能完全消除QS活性，而是将QS活性降低了约80%。这一结果强调了该修饰在将GBAP转化为抑制剂过程中的重要性，同时也表明需要第二个修饰才能完全消除激动活性。此外，拮抗剂文库的综合结果表明，尾部区域对拮抗活性的重要性高于对激动活性的重要性，因此尾部区域的修饰耐受性较低（比较表1和表2与表3的活性趋势）。

由于我们发现苄基酪氨酸修饰足以将GBAP转化为部分抑制剂，而需要额外的修饰才能将肽转化为完全竞争性抑制剂，因此我们尝试引入增强的激动剂修饰（q1n2或n2P4A）连接到该最小修饰的支架上，分别得到46和47。不幸的是，这两种类似物的活性均低于其母体支架（44），进一步强调了尾部修饰与苄基‐酪氨酸环修饰之间的不兼容性。

难以合成的基于GBAP的类似物的合成

我们立即发现，我们完全采用的树脂上合成方法与32及其类似物所基于的支架不兼容，因为我们的方法所使用的两个树脂连接点（天冬酰胺5和谷氨酰胺9）在设计中已被移除（方案S‐1）。因此，需要一种替代的合成方法。最初，我们遵循了文献报道的拮抗剂合成中引用的方法（方案S‐1）。25, 27然而，在我们的实验条件下，该方法产率极低，并且在肽链多个位点发生严重的差向异构化。此外，如上所述，化合物32的抑制活性远低于预期。

我们假设，合成方法特别是困难的环化步骤可能是导致活性不一致的原因。为了帮助解决产率问题以及观察到的效价不一致的情况，我们开发了一种替代的合成方法，该方法引入了我们完全在树脂上方法中的一些策略，即在树脂上进行酯形成，然后通过酰胺形成在溶液中进行简便的环化（方案S‐1）。使用这种替代方法制备的肽（32）仍然无活性，这表明合成方法的差异并不是我们在实验中可重复观察到的显著较低活性的原因。此外，当与我们的完全树脂上合成兼容的最相似肽（36）使用与制备32相同的方法重新合成时，36保持了其效价。综合来看，这些结果进一步证实了我们合成方法的有效性，以及我们在实验中观察到32缺乏活性的真实性。

尽管我们引入的合成修饰使我们能够制备大多数计划中的肽，包括32，但由于在溶液中环化后脱保护N端所涉及的额外步骤导致产率极低，我们仍无法制备一种缺少N端封端基团的计划类似物（参见SI中对此特定肽所用方法的描述）。此外，虽然改进的合成方法已将异构体的生成减少到更合理的水平，但仍至少存在一种显著且难以去除的污染物（一种异构体），该异构体经测试确认无活性。

在表型测定中评估先导拮抗剂

尽管我们的报告基因检测已证实这些肽具有调节群体感应反应的能力，但我们还想验证这种调节是否可转化为对治疗上重要表型的调控。为此，我们测试了先导拮抗剂35在野生型粪肠球菌细胞（菌株TX4002）中减弱生物膜形成的能力。由于生物膜形成也可能受到其他通路的影响，我们纳入了一个群体感应失活菌株（TX5266）作为对照（图4和S‐1）。

我们发现，向细胞中添加外源性GBAP可使生物膜形成量增加约30‐50%。然而，无论是 否添加外源性GBAP，只要加入浓度比其IC50高5倍的化合物35，即可将生物膜形成减少 至群体感应失活菌株的水平（减少约30‐50%）。这些结果表明，即使存在足量的天然激 活剂以充分诱导群体感应反应，该拮抗剂仍能完全抑制依赖于群体感应的生物膜形成。

结论

我们利用当前及以往对GBAP信号的构效关系知识，合理设计出活性增强的基于GBAP的群体感应调节剂。为此，我们开发、优化并比较了三种用于构建GBAP类似物的合成路线。结果表明，完全采用树脂上合成方法在效率、纯化难易程度以及总收率方面均优于两种溶液相环化方法。

我们设计的增强型激动剂库获得了多个活性显著提高的类似物（效价提高>20倍）。该库还揭示了若干互不兼容的修饰，当这些修饰组合时会导致效价降低。推测这种不兼容性的原因可能是各修饰所诱导的构象变化引入了空间位阻，但尚需进一步的结构研究来证实这一点。图5总结了从激动剂库中获得的关键构效关系结论。

关于基于GBAP的竞争性抑制剂，我们发现单个修饰（N5[ YBzl]）足以将GBAP转化为一种在纳摩尔范围内具有IC50 值的强效抑制剂，即使在存在大量天然竞争物的情况下也是如此。这一结果强调了验证所有修饰的必要性，以正确归因所观察到的构效关系与其相关修饰之间的关联（早期采用反向丙氨酸扫描方法的研究能够识别出这种意外的修饰具有重要作用，但更强调丙氨酸取代对所观察到的构效关系的贡献）。27我们对基于GBAP的拮抗剂进行的系统分析揭示了效力提高>50‐倍的强效抑制剂，相较于先前报道的先导化合物（32）。因此，这些新类似物是设计具有潜在治疗意义的基于GBAP的群体感应抑制剂的优势骨架。事实上，我们的先导抑制剂35能够完全抑制野生型粪肠球菌菌株中的致病表型——生物膜形成，其抑制水平可与群体感应失活菌株相媲美。

综合本研究获得的构效关系（SAR）见解，提示了若干可进一步改善结合能力的区域，或可耐受的修饰位点，这些修饰可能有助于提高肽类似物的稳定性。首先，在可耐受位点（如Phe7）引入额外的D‐氨基酸，可提高肽对蛋白酶降解的稳定性。稳定性的提升可能抵消效价上的轻微损失，特别是在本身已具有高活性的肽中。在Phe7位引入D‐色氨酸取代，其效价接近天然肽，可能在几乎不影响效价的情况下显著提高肽的稳定性。其次，环外尾部区域能够显著改变激动剂和拮抗剂的效价。这可通过改变环外尾部残基的立体化学或通过N‐末端封端来实现。此类旨在进一步提高激动剂和拮抗剂效价的实验，以及深入的结构研究以阐明驱动GBAP‐FsrC结合并导致FsrC激活的分子机制，目前正在本实验室进行，将在适当时候予以报道。